王 勇,張炯怡,謝明軍,宋曉寧,馬 瑩 ,張志勇

(1.貴州省食品藥品檢驗所，貴州貴陽 550004；2.貴州省食品檢驗檢測院，貴州貴陽 550004；3.貴州省藥品監(jiān)督管理局，貴州貴陽 550004)

在新藥的研究與開發(fā)過程中，臨床前藥代動力學研究具有重要的意義，良好的藥代動力學性質和較低毒副作用是藥物通過臨床試驗的關鍵，也是先導物篩選、結構優(yōu)化的重要參考依據。統(tǒng)計數據顯示，藥物研究過程中，由于藥代動力學參數不理想而淘汰的藥物，占到新藥開發(fā)的50%。因此，在藥物研發(fā)早期進行藥代動力學研究，可更快捷地獲得安全有效的活性藥物，并通過藥物在體內的吸收、分布及消除特點，為活性藥物的結構改造提供科學依據。

酸漿屬茄科酸漿屬植物PhysalisalkekengiL.var.franchetii，又名紅姑娘、 掛金燈、 燈籠草等[1]。酸漿性寒味苦，歸肺經，具有清熱解毒、利咽化痰、利尿通淋等功效，常用于咽痛音啞、痰熱咳嗽、小便不利、熱淋澀痛、天皰瘡和濕疹治療[2]。我國酸漿的野生資源豐富，全國大部分地區(qū)均有分布，北方較多，吉林、河北、新疆等地為主要產區(qū)[3]。據研究報道，錦燈籠具有抗炎、抗菌、利尿、抗癌等多種藥理作用[1]。酸漿的化學成分早期已被廣泛報道[4-5]，目前為止，從酸漿中已經分離出120多種成分[6]，包括生物堿、甾體、黃酮和苯丙素類等。其中，甾體(主要為酸堿苦味素類)被廣泛認為是酸漿的特征活性物質。

本課題組長期致力于研究酸漿在治療胃潰瘍方面的應用，前期結果顯示，酸漿超微粉以及酸漿乙酸乙酯萃取部位均具有顯著的抗炎和抗胃潰瘍活性，而且對幽門螺桿菌(Hp)具有一定抑制活性[7-8]。通過進一步研究，發(fā)現(xiàn)酸漿苦味素B是酸漿抗胃潰瘍活性的物質基礎，具有顯著的體內抗胃潰瘍活性[9]，有一定的開發(fā)價值。為了進一步了解酸漿苦味素B在體內的吸收和分布規(guī)律，本研究對其藥代動力學參數及組織分布進行系統(tǒng)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物和試劑 酸漿苦味素B，貴州省食品藥品檢驗所科研室自制；安西萘德(批號：510020-201401，純度為99.5%)，中國食品藥品檢定研究院產品；甲酸(色譜純)和羧甲基纖維素鈉(分析純)，天津市科密歐化學試劑有限公司產品；乙酸乙酯(色譜純)，上海安譜實驗科技股份有限公司產品；乙腈(色譜純)，德國默克股份兩合公司產品；氯化鈉(優(yōu)級純)，國藥集團化學試劑有限公司產品。

1.1.2 實驗動物 SD大鼠(180 g～220 g)，購自貴州醫(yī)科大學實驗動物中心(證書編號：SCXK 2002-0001，中國貴陽)。試驗前適應實驗室環(huán)境3 d，在相對溫度25 ℃±2 ℃和相對濕度50%±5%，12 h光照與12 h黑暗的標準條件下用聚丙烯鼠籠分開飼養(yǎng)。動物試驗方法經貴州醫(yī)科大學動物委員會認可。試驗前禁食12 h，自由飲水。

1.1.3 儀器設備 液質聯(lián)用儀(UPLC-MS，型號：Xevo TQ，MassLynx V4.1工作站)，沃特世科技有限公司產品；電子天平(XS105DU)、精密度酸度計(SevenExcellence)，梅特勒-托利多國際有限公司產品；離心機(RPM/RCFX1000)，丹麥ScanSpeed公司產品；渦旋混合器(Stander vortex mixer)，美國Talboys公司產品；超聲波清洗儀(KQ500DE)，昆山市超聲儀器有限公司產品；電熱鼓風干燥箱(GZX-9240MBE)，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠產品；純水-超純水一體機系統(tǒng)(明澈D24UA)，德國默克密理博公司產品。

1.2 方法

1.2.1 分析條件的建立

1.2.1.2 質譜條件 離子源：ESI；檢測方式：正離子模式；掃描方式：多反應監(jiān)測MRM；選擇監(jiān)測離子對：酸漿苦味素B為m/z 493.33/475.255，安西奈德為m/z 338.9/321；毛細管電壓：4 000 V；錐孔電壓：酸漿苦味素B為28 V，安西奈德為20 V；去溶劑溫度：500 ℃；離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣流量：1 000 L/Hr；反吹氣流量：50 L/Hr；碰撞能量：493.33為16 V，475.255為18 V，338.9為10 V，321為10 V。

1.2.2 試驗準備

1.2.2.1 內標的選擇 在進行液相質譜分析時，對于理想內標物的選擇，應具有穩(wěn)定、結構與待測物相似、質量數差別不大、色譜行為也能接近，如保留時間應盡量接近待測物等特征，其中待測物的同位素普遍認為是最理想的內標物，但本研究中酸漿苦味素B的氘代物難以制備。因此，通過對與酸漿苦味素B結構相似的41種糖皮質激素類甾體化合物進行篩選，以尋找最佳的內標物質。

1.2.2.2 溶液的配制 酸漿苦味素B標準溶液的配制：精密稱取10.4 mg酸漿苦味素B，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得1.04 mg/mL的儲備液。精密取適量儲備液，用甲醇稀釋得5 200、2 600、520、260、52、26、5.2 ng/mL濃度的系列標準工作溶液，置-20 ℃保存。

安西萘德內標溶液的配制：精密稱取10.9 mg酸漿苦味素B，置于10 mL容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得1.09 mg/mL的內標儲備液。精密量取內標儲備液100 μL，置于100 mL容量瓶中，甲醇稀釋得1.09 μg/mL的內標溶液，置-20 ℃保存。

1.2.2.3 生物樣品的采集與制備

(1)給藥方案 藥代動力學研究：取SD大鼠15只，雌雄各半，體重180 g～230 g，分為高、中、低3個劑量組，每組5只，試驗前禁食1 d，自由飲水。試驗時，3組給藥劑量分別為4.968、9.935、19.87 mg/kg。

組織分布研究：取SD大鼠18只，雌雄各半，體重180 g～230 g，分為3組，每組6只，試驗前禁食1 d，自由飲水。 試驗時， 3組給藥劑量均為19.87 mg/kg。

(2)血漿的采集與制備 每個劑量組在灌胃后不同時間點分別于尾靜脈取血，收集于含肝素鈉的玻璃離心管，3 000 r/min離心10 min，分離得上清即為血漿，置-80 ℃保存。

(3)組織的采集與勻漿液的制備 經給藥后不同時間點，分別處死一組大鼠，立即取腦、心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸、卵巢、脂肪和肌肉組織各2 g，表面用生理鹽水將血液清洗干凈后，用濾紙吸干水分，稱重，至于玻璃勻漿管中，加入3倍生理鹽水進行研磨勻漿，即得各組織勻漿液，置-80 ℃保存。

1.2.2.4 大鼠血漿與組織樣品的預處理 取血漿或組織勻漿液300 μL于1.5 mL EP管中，加入內標溶液400 μL，渦旋2 min，加入800 μL乙酸乙酯，渦旋2 min，超聲提取10 min，12 000 r/min離心5 min，精密吸取400 μL上層乙酸乙酯提取液，至新的EP離心管中，40 ℃氮氣吹干，殘留物以800 μL 500 mL/L甲醇水溶液復溶，12 000 r/min離心5 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾，裝進樣小瓶，備用。

1.2.3 方法學驗證 本研究的分析方法通過歐洲藥品管理局(European Medicine Agency,EMA)關于生物分析方法驗證指導方針進行驗證[1]，依次考察方法的專屬性、線性范圍、檢出限、定量限、日內精密度、日間精密度、準確度、提取回收率、基質效應和穩(wěn)定性。

1.2.3.1 方法的專屬性 取大鼠空白血漿或空白組織勻漿液200 μL，除內標安西奈德用200 μL甲醇代替外，氮氣吹干后按“血漿與組織樣品的預處理”項下方法操作，進樣5 μL，得色譜圖；取200 μL一定濃度的酸漿苦味素B和安西奈德內標混合溶液，氮氣吹干后，加入200 μL空白血漿或空白組織液，依同法操作，得色譜圖；取大鼠口服灌胃酸漿苦味素B后的血漿樣品或組織勻漿液，加入200 μL內標溶液，同法操作，得色譜圖。通過分析比較，考察酸漿苦味素B和內標物質的專屬性。

1.2.3.2 線性范圍、檢出限和定量下限 分別取400 μL系列濃度對照品溶液，按“血漿與組織樣品的預處理”項處理，配制成相當于酸漿苦味素B血漿、腦勻漿液、心勻漿液、肝勻漿液、脾勻漿液、肺勻漿液、腎勻漿液、小腸勻漿液、大腸勻漿液、直腸勻漿液、卵巢勻漿液、脂肪勻漿液和肌肉勻漿液質量濃度分別為1.3、6.5、13、65、130、650、1 300 ng/mL的系列標準溶液， 以及相當于酸漿苦味素B胃勻漿液和十二指腸勻漿液質量濃度分別為1.3、6.5、13、65、130、650、1 300、6 500 ng/mL的系列標準溶液，12 000 r/min離心10 min，上清過0.22 μm的濾膜，取5 μL進行UPLC-MS/MS分析。按色譜峰信噪比約等于3∶1時酸漿苦味素B的濃度為最低檢出限，信噪比約等于10∶1時酸漿苦味素B的濃度為定量限。

1.2.3.3 精密度與準確度 取空白血漿和空白組織勻漿液300 μL按上述“血漿與組織樣品的預處理”制備低、中、高3個濃度質控樣品，每個濃度進行5樣本分析，連續(xù)測定3 d，根據隨行標準曲線計算QC樣品的濃度，濃度值的相對標準偏差(RSD)即為精密度，準確度則通過相對誤差表示(RE)，即(實測濃度-加入標準濃度)/加入標準濃度×100%，準確度應在±15% 范圍內，日內精密度和日間精密度不能超過15%，定量限附近的RSD和RE應小于20%。

1.2.3.4 提取回收率與基質效應 取高、中、低3個濃度對照各400 μL，按“血漿與組織樣品的預處理”操作制備不同濃度的血漿和組織樣品，進樣5 μL，記錄峰面積A2。同時另取大鼠空白血漿或空白組織勻漿液各300 μL，除不加系列濃度對照和內標混合溶液外，按“血漿或組織樣品預處理方法”項下操作，在獲得的400 μL空白血漿或空白組織勻漿液的乙酸乙酯萃取液中加入200 μL高、中、低濃度的對照和內標混合溶液，氮氣吹干，殘留物用800 μL 500 mL/L甲醇水溶液復溶，取5 μL進樣分析，記錄峰面積A3。取高、中、低3個濃度對照各200 μL，置于1.5 mL離心管，氮氣吹干后直接用800 μL 500 mL/L甲醇水溶液復溶，記錄分析得峰面積為A1。各濃度制備平行樣5份。計算公式為：

提取回收率=(A2/A3)×100%

基質效應=(A3/A1)×100%

1.2.3.5 穩(wěn)定性 取相應濃度對照溶液400 μL，按“血漿與組織樣品的預處理”制備高、中、低3個濃度血漿和組織勻漿液樣品各5份。用于考察含藥血漿或組織樣品處理好后溶液中分析物在自動進樣器放置12 h、室溫放置12 h、-20 ℃儲存4周和反復凍融3次的穩(wěn)定性。以測得值占QC樣品已知濃度的百分率表示待測物的穩(wěn)定性。

1.2.4 數據分析 采用藥代動力學處理軟件DAS2.0非房室模型法，計算藥代動力學參數，運用SPSS對試驗數據進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 內標物質的選擇

選擇內標時，先后考察了41種糖皮質激素類甾體化合物，其中安西奈德與酸漿苦味素B結構相似、分子質量相近、具有相似的物理化學性質、峰形和出峰時間相接近且化學性質穩(wěn)定，并且其在后續(xù)各基質中的提取回收率與基質效應較一致，綜合考慮，選擇安西奈德作為本研究的內標物質。

2.2 方法學考察結果

2.2.1 專屬性 采用上述試驗所優(yōu)化的LC-MS/MS條件，酸漿苦味素B和安西奈德的保留時間分別為3.96 min和4.32 min。如圖1和圖2所示，酸漿苦味素B和內標安西奈德互不干擾，空白血漿和空白組織液中的內源性物質不干擾待測物和內標的測定，鋒形良好，無雜峰，基線平穩(wěn)，說明該方法具有良好的專屬性。

A.空白大鼠血漿；B.空白大鼠血漿加入酸漿苦味素B和安西奈德；C.大鼠灌胃給藥后的血漿樣品

2.2.2 線性范圍、檢出限和定量下限 以對照峰面積與內標峰面積的比值為縱坐標y，酸漿苦味素B血漿或組織勻漿液質量濃度為橫坐標x，采用最小加權二乘法(W=1/X2)進行線性回歸，求得標準曲線的方程為：y=ax+b。結果表明，酸漿苦味素B血漿樣品及各組織樣品在1.3 ng/mL～1 300 ng/mL和1.3 ng/mL～6 500 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，相關系數均大于0.99。同時，定量限均為1.3 ng/mL，檢出限均為0.325 ng/mL。

2.2.3 精密度和準確度 3個不同濃度質控樣的日內精密度，日間精密度和準確度結果顯示，酸漿苦味素B日內精密度的RSD范圍是0.68%～12.42%，日間精密度的RSD范圍是2.89%～12.31%，且準確度的相對誤差范圍在-8.34%～+9.41%之間，說明所使用的方法對于血漿和組織勻漿液中酸漿苦味素B的測定是準確和可重復的，符合生物樣品分析方法的要求。

A.空白大鼠胃組織勻漿液；B.空白大鼠胃組織勻漿液加入酸漿苦味素B和安西奈德； C.大鼠灌胃給藥后的胃組織勻漿液樣品

2.2.4 提取回收率與基質效應 試驗結果顯示，高、中、低3個濃度血漿和組織勻漿液樣品提取回收率范圍為91.7%～112.22%，內標物質安西奈德在各基質的提取回收率為94.17%～118.77%，RSD<15%。同時，3個濃度LC-MS/MS基質效應范圍為91.68%～109.70%，內標安西奈德在各基質中的基質效應為93.50%～106.03%。說明血漿或不同組織勻漿液樣品中酸漿苦味素B和安西奈德的測定沒有顯著的基質效應，符合生物樣品分析方法的要求。

2.2.5 穩(wěn)定性 血漿和組織液樣品在自動進樣器放置12 h、室溫放置12 h、-20 ℃儲存4周和反復凍融3次的穩(wěn)定性分析數據顯示，RSD均在14.19%以內，說明各化合物的穩(wěn)定性良好。

2.3 血藥濃度數據的測定及濃度時間曲線

大鼠口服灌胃4.968、9.935、19.87 mg/kg 3個劑量酸漿苦味素B后，于不同時間點采集大鼠血液，運用經過方法學驗證后的UPLC-MS/MS方法對收集的血漿進行測定，計算每個時間點對應的血藥濃度，繪制濃度時間曲線(圖3)。

圖3 口服灌胃各劑量組酸漿苦味素B后大鼠血漿中的藥物濃度-時間曲線(n=6)

2.4 酸漿苦味素B在大鼠體內的藥代動力學參數

本研究運用DAS2.0軟件，通過非房室模型對酸漿苦味素B在大鼠體內的血藥濃度進行擬合，求算其藥代動力學參數。主要藥代動力學參數見表1。由分析結果可知，3個劑量組的平均血藥濃度峰值Cmax分別為(169.086±6.641)μg/L、(247.513±23.434)μg/L和(619.567±28.201)μg/L，達峰時間Tmax均為0.667 h，終末半衰期t1/2z分別為(8.975±2.966)h、(10.022±3.196)h和(5.912 h±2.271)h，清除率CLz/F分別為(5.722±0.796)L/h·kg、(7.001 7±1.196)和(6.277±0.693)L/h/kg，藥時曲線下峰面積AUC(0-24)分別為(748.735±47.13)μg/L·h、 (1 189.897±100.436)μg/L·h和(2 963.312±176.7)μg/L·h，表觀分布容積Vz/F分別為(71.599±17.172)L/kg、(97.046±21.549)L/kg和(51.917±15.641)L/kg，平均駐留時間MRT(0-24)分別為(6.811±0.372)h、(7.342±0.401)h和(6.304±0.381)h。結果顯示,酸漿苦味素B灌胃后在大鼠體內吸收迅速，與之前文獻[5]報道的酸漿苦味素D、酸漿苦味素G和4,7-二脫氫新酸漿苦味素B的大鼠藥動參數相似，這可能與酸漿苦味素B的結構相關。

表1 3個劑量下酸漿苦味素B的藥動學參數

2.5 酸漿苦味素B在大鼠體內的組織分布情況

大鼠在20、50、180 min 3個時間點以19.87 mg/kg劑量灌胃酸漿苦味素B后，在腦、心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、小腸、大腸、直腸、卵巢、脂肪和肌肉14個組織中均有檢出相應濃度，表明酸漿苦味素B經灌胃后，可迅速分布于各組織中(表2)，分布順序如下，給藥20 min后：胃>十二指腸>肺>卵巢>脂肪>腎>肝>小腸>直腸>大腸>脾>心>肌肉>腦；給藥50 min后：胃>十二指腸>小腸>腎>脂肪>卵巢>肝>脾>直腸>心>肺>大腸>肌肉>腦；給藥180 min后：十二指腸>胃>肝>小腸>脂肪>大腸>直腸>肺>心>卵巢>肌肉>腎>脾>腦。由表中的數據可以看出，腦、心、肝、脂肪、肌肉和直腸中酸漿苦味素B的含量隨著時間的增加濃度逐漸增高；脾、腎、胃、十二指腸和小腸組織中酸漿苦味素B的濃度在50 min時達到峰值，180 min時濃度出現(xiàn)下降的趨勢；卵巢中酸漿苦味素B的濃度隨時間的增加濃度逐漸降低；20 min時，肺、大腸和脂肪組織中酸漿苦味素B濃度高，50 min時濃度降低，180 min時有所增加；肺在20 min時濃度達到峰值，大腸在180 min時達到峰值。綜合各數據，酸漿苦味素B主要分布于胃、十二指腸和小腸組織，而腦中的含量在3個時間點均最低。

表2 大鼠口服灌胃19.87 mg/kg酸漿苦味素B后不同時間點藥物在各組織中的分布情況

3 討論

液相色譜-質譜-質譜聯(lián)用技術(LC-MS/MS)技術自20世紀70年代問世以來，經過快速的發(fā)展和更新?lián)Q代，技術已趨于成熟[10]，目前被廣泛運用于中藥的鑒別、質控、篩選，以及藥代動力學方面的研究[11-12]。進行藥物的藥代動力學研究，是為了從具有復雜基質的生物樣本中定量檢測出需要的微量目標物，但由于生物樣品基質復雜，待測物濃度較低，待測樣本數量大，因此在藥代動力學研究中，建立準確、快速、靈敏和高通量的生物樣品定量分析方法是關鍵點，而LC-MS/MS以其對多種藥物的通用性，檢測的專屬性，高靈敏度和快速的分析時間方面的優(yōu)勢，已迅速成為一種在藥代動力學研究中不可或缺的測量工具[13-15]。現(xiàn)已有關于源自酸漿的酸漿苦味素D、酸漿苦味素G和4,7-二脫氫新酸漿苦味素B在大鼠體內進行藥代動力學研究的文獻報道[16]，但關于酸漿苦味素B的藥代動力學考察，目前只有1篇靜脈注射給藥方式的相關研究[17]。對于口服給藥方式的研究，目前尚未見報道。

本研究應用DAS2.0軟件對測定數據進行了一房室模型，二房室模型和非房室模型計算，結果發(fā)現(xiàn)相比較一房室模型和二房室模型，非房室模型的擬合值更接近于真實值，因此，本研究選擇非房室模型對測定血藥濃度時間值進行計算。試驗結果顯示，灌胃不同劑量的酸漿苦味素B，血漿的含藥量隨給藥劑量的增加而增高，呈劑量依賴關系。對于AUC來說，也呈現(xiàn)成比例的劑量依賴關系，劑量增長比例為1.0∶2.0∶4.0時，AUC值的比例為1∶1.6∶4.0。藥物在血漿中的達峰時間均為0.667 h，一方面，表明藥物經灌胃后吸收較快，另一方面，說明達峰時間與用藥劑量無關。將3個劑量的半衰期進行t檢驗，低劑量與中劑量之間無顯著差異(P>0.05)，低劑量與高劑量之間無顯著差異(P>0.05)，但中劑量與高劑量之間差異顯著(P<0.05)，說明藥物半衰期與劑量有關。酸漿苦味素B在體內的半衰期 t1/2z較長，表觀分布容積Vz/F較高，駐留時間MRT長，說明酸漿苦味素B存在組織器官蓄積的潛在可能，結合本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[9]，酸漿苦味素B在灌胃24 h后造模，仍對胃潰瘍具有較好的保護作用，說明酸漿苦味素B各劑量給藥后，作用于機體的時間較長，體內代謝較慢，能較好地發(fā)揮其抗胃潰瘍作用。

大鼠靜脈注射酸漿苦味素B(5 mg/kg)后，血藥濃度于給藥后5 min達到峰值[17]，本試驗通過口服低濃度酸漿苦味素B(4.968 mg/kg)后，達峰時間為0.667 h，明顯慢于靜脈注射，半衰期t1/2z(8.975 h±2.966 h) 也明顯慢于靜脈給藥方式(321.2 min±29.5 min)，結果說明，靜脈注射酸漿苦味素B的吸收速率明顯大于口服給藥，這可能是因為靜脈注射給藥后，藥物可直接通過血液循環(huán)分布到各組織器官，而口服灌胃給藥時，藥物會受到各種酶的降解[18]、或者食物吸收的影響。

由于機體個體差異、各組織器官生理特征的差異以及藥物的理化性質，致使藥物在體內的分布具有一定的差異性。而這種差異性與藥物的療效和毒副作用相關，因此對藥物的組織分布進行研究，尋找藥物的作用靶點具有重要意義。進行酸漿苦味素B組織分布研究時，在藥代動力學參數測定的基礎上，根據藥時曲線確定了20、50、180 min 3個分別代表分布相、平衡相和消除相的時間點進行組織取樣測定。試驗結果表明，本試驗幾乎所有時間點的血藥濃度均高于相應時間點的組織濃度，此結果有助于理解前期的研究發(fā)現(xiàn)[9]，為何低血藥濃度酸漿苦味素B仍能發(fā)揮顯著的抗胃潰瘍作用。此外，從組織分布數據可以看出，胃、十二指腸和小腸含量明顯高于其他組織，其中胃組織中的含量在20 min和50 min時均高于其余組織，180 min時略低于十二指腸，說明胃和十二指腸可能是酸漿苦味素B口服后的主要吸收部位，表明酸漿苦味素B在胃腸吸收較慢且不完全，結合前期研究發(fā)現(xiàn)酸漿苦味素B具有較顯著的抗胃潰瘍作用，推測胃和十二指腸可能是酸漿苦味素B作用的靶器官和組織，多次服用后導致藥物在胃和十二指腸中蓄積，增加藥物濃度，可能是酸漿苦味素B發(fā)揮藥效的一個重要原因。另外，大鼠體內血流量較豐富的組織器官如腦、心、肝和腎，酸漿苦味素B濃度較低，幾乎與胃和十二指腸相差一個數量級，說明組織血流量對藥物的分布影響不大，腦中的濃度最低，但仍有明顯分布，說明藥物可能會透過血腦屏障，這與文獻[17]報道相吻合。這些都提示了酸漿苦味素B潛在的良好的藥物開發(fā)前景，為藥物的進一步開發(fā)提供了有價值的參考。