陳非玥,洪龍勝,李婉雁,梁舒棋,肖詠儀,田允波,許丹寧,曹 楠*

(1.仲愷農業(yè)工程學院，廣東廣州 510225； 2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點實驗室，廣東廣州 510225)

免疫器官是機體執(zhí)行免疫功能的主要場所及防御侵害的天然屏障。毒物、細菌、病毒等可使機體免疫細胞增殖受抑制，免疫器官發(fā)育受損，從而影響機體免疫應答能力。在小鼠淋巴結腫大、中性粒細胞增生、脾內巨噬細胞增生和浸潤等病理過程中，致病因子常通過作用于MAPKs信號通路來介導相關的炎癥反應[1-2]。據報道，p38/MAPK受藥物抑制后，可使動物胸腺中早期T細胞發(fā)育阻滯、胸腺細胞數量減少，造成胸腺免疫功能障礙[3-5]，并使脾細胞凋亡損傷，對機體產生不良影響[6]。

近年來，中草藥多糖因其低毒性、多靶點、不易產生耐藥性等優(yōu)點得以廣泛應用。值得注意的是，多糖通常存在一個發(fā)揮其功效的最適濃度范圍，濃度過高可能會抑制部分免疫細胞的免疫活性。白術多糖(polysaccharide ofAtractylodesmacrocephalaKoidz，PAMK)是白術發(fā)揮其生物功效的主要成分。已有研究表明，白術多糖及其他補益類中藥多糖可提升機體免疫器官指數，促進淋巴細胞的增殖與分化，增強巨噬細胞、NK細胞等免疫細胞的活性，促進細胞因子生成與分泌，參與抗體和補體的形成，并可激活MAPK/AP-1信號通路誘導DC細胞成熟[7-9]。因此，研究不同濃度的白術多糖對動物機體免疫功能的調節(jié)作用具有一定理論意義，可為相關的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 白術多糖 白術多糖(PAMK)，多糖含量為95%，西安市天園生物制劑廠產品。

1.1.2 實驗動物 40只4周齡雌性Balb/c小鼠，購于南方醫(yī)科大學。

1.1.3 主要試劑 40 mg/mL多聚甲醛通用型組織固定液(BL539A)，廣州賽國生物科技有限公司產品；高效切片石蠟，上海華申康復器材有限公司產品；TRIzol RNA分離試劑(15596026)，美國Ambion公司產品；2×PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(A25742)，美國Applied Biosystems公司產品；反轉錄試劑盒(Rr036A)，TaKaRa公司產品。

1.1.4 主要儀器 電子天平(FA1604)，上海精密科學儀器有限公司產品；石蠟包埋機(EC300)、石蠟切片機(HM340E)，德國MICROM公司產品；雙目顯微鏡(ECLIPSE E100)，日本Nikon公司產品；超微量紫外分光光度計(Epoch)，美國Bio-Tek公司產品；實時熒光PCR儀(PRISM 7500)，美國Applied Biosystems公司產品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 將試驗小鼠隨機分為5組，分別為對照組與4個不同濃度的白術多糖處理組。其中，處理組給藥劑量為每日100、200、400、600 mg/kg，對照組給予等劑量的生理鹽水，連續(xù)灌胃14 d。飼養(yǎng)環(huán)境均處于同一水平：溫度18 ℃～29 ℃，相對濕度40%～70%，氨濃度≤15 mg/m3，每天定時稱重給藥、更換墊料，并提供充足的飼糧和飲用水。

1.2.2 胸腺與脾臟指數測定 飼養(yǎng)至第15天時對小鼠進行活體稱重，隨后處以安樂死，在無菌環(huán)境下采集胸腺與脾臟，分別稱重，按照以下公式計算胸腺指數與脾臟指數。

胸腺指數=胸腺重量(mg)/體重(g)；

脾臟指數=脾臟重量(mg)/體重(g)。

1.2.3 胸腺與脾臟組織顯微結構觀察 切取0.5 cm3的組織塊，于40 mg/mL多聚甲醛溶液中固定，制備石蠟切片，具體參照何書海等[10]的方法進行。通過正置顯微鏡觀察胸腺與脾臟組織結構，并利用CCD采集圖像。

1.2.4 real-time PCR檢測基因表達量 使用TRIzol提取胸腺與脾臟組織總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量、超微量紫外分光光度計測定RNA濃度，再根據濃度用反轉錄試劑盒進行逆轉錄獲得cDNA，將cDNA保存于-20 ℃冰箱備用。

根據NCBI數據庫序列，設計合成相關引物。引物名稱與序列信息見表1。采用SYBR Green熒光染料法進行目的基因表達檢測，總反應體系20 μL，包括 cDNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL，dH2O 7 μL。反應條件為:50 ℃ 2 min;95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 25 s，共40個循環(huán)。采用2-△△Ct算法計算小鼠胸腺組織與脾臟組織中p38/MAPK信號通路相關的關鍵基因ASK1、p38、MSK1/2 mRNA的相對表達量，以GAPDH作為內參基因。

表1 引物序列信息

1.2.5 數據統(tǒng)計與分析 試驗數據使用Prism 7.0軟件進行單因素方差分析，Tukey多重比較法進行組間比較，結果以“平均值±標準差”表示。

2 結果

2.1 各組小鼠體重、胸腺與脾臟重、胸腺與脾臟指數的比較

結果見表2。由表2可知，相比于對照組，添加100、200、400 mg/kg白術多糖均可上調胸腺指數，而添加200、400、600 mg/kg白術多糖則可上調脾臟指數，且濃度為200 mg/kg時，胸腺與脾臟的重量及器官指數皆顯著升高(P<0.05)，說明添加200 mg/kg白術多糖可更好的促進免疫器官發(fā)育，并更有利于機體的新陳代謝。

表2 各組小鼠體重、胸腺與脾臟重、胸腺與脾臟指數的比較

2.2 不同濃度白術多糖對小鼠胸腺組織結構的影響

結果見圖1。由圖1可知，對照組胸腺皮質厚度與髓質面積適中，皮質內淋巴細胞排列整齊，髓質內散布著胸腺上皮細胞，細胞形態(tài)良好，被膜結構完整。與對照組相比，100 mg/kg組胸腺組織結構無明顯變化；200 mg/kg組胸腺組織中皮質相對較厚、染色較深，其中富含胸腺細胞，整體而言細胞分布排列規(guī)則整齊；而400 mg/kg組和600 mg/kg組的胸腺組織均呈現出皮質略薄、染色較淺的狀態(tài)，且400倍鏡下可見600 mg/kg組的細胞排列稍為疏松。

2.3 不同濃度白術多糖對小鼠脾臟組織結構的影響

結果見圖2。由圖2可知，對照組脾臟組織結構正常，白髓與紅髓交叉分布，動脈周圍淋巴鞘輪廓較為明顯，大小適中，淋巴細胞排列規(guī)整。而相比于對照組，100 mg/kg組的白髓結構正常，動脈周圍淋巴鞘稍有增大，但整體結構無明顯變化；200 mg/kg組的脾臟組織中，動脈周圍淋巴鞘面積增大，淋巴細胞密集且排列規(guī)則整齊；400 mg/kg組的脾臟組織中，紅髓與白髓的結構及界限清晰，但白髓面積及動脈周圍淋巴鞘大小無明顯變化；600 mg/kg組的脾臟組織中，動脈周圍淋巴鞘面積有所增大，但細胞排列較為疏松。

A～E.對照組、白術多糖100、200、400、600 mg/kg組(100×)；a～e.對照組、白術多糖100、200、400、600 mg/kg組(400×);▲.髓質；★.皮質

A～E.對照組、白術多糖100、200、400、600 mg/kg組(100×)；a～e.對照組、白術多糖100、200、400、600 mg/kg組(400×)；→.動脈周圍淋巴鞘

2.4 不同濃度白術多糖對小鼠胸腺組織p38/MAPK信號通路相關關鍵基因mRNA相對表達量影響

結果如圖3所示。200 mg/kg組胸腺組織與脾臟組織內關鍵基因mRNA相對表達量的上調趨勢最為明顯。在胸腺組織樣品組，200 mg/kg組ASK1、MSK2 mRNA的相對表達量顯著高于其他組別(P<0.05)，p38 mRNA的相對表達量顯著高于對照組與600 mg/kg組(P<0.05)。此外，600 mg/kg組ASK1、p38、MSK1/2 mRNA的相對表達量均低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)，表明600 mg/kg對p38/MAPK信號通路可能存在負性調節(jié)作用。

2.5 不同濃度白術多糖對小鼠脾臟組織p38/MAPK信號通路相關關鍵基因mRNA相對表達量影響

結果如圖4所示。相比于對照組，400 mg/kg組ASK1、MSK2 mRNA的相對表達量顯著上調(P<0.05)，200 mg/kg組p38、MSK1/2 mRNA的上調趨勢則更為顯著(P<0.05)，說明400 mg/kg對p38/MAPK信號通路有一定程度的正向調節(jié)作用，但作用效果遠不及200 mg/kg組明顯。

3 討論

胸腺是T細胞發(fā)育、分化、成熟的場所。研究表明，小鼠通常在18日齡后胸腺重量就開始下降，主要表現為皮質變薄，皮質與髓質面積比下降、分界逐漸模糊，胸腺小體數量減少等[11-12]。脾臟是免疫細胞定居的場所，同時作為血液循環(huán)中重要的過濾器官，可清除血液內的病原體、衰亡的血細胞與免疫復合物等[13-14]。胸腺和脾臟分別代表動物的中樞免疫器官和外周免疫器官，其組織形態(tài)結構的完整性與否代表著動物免疫機能是否健全。相關病理組織學研究顯示，蘆薈多糖可使衰老小鼠的胸腺富含淋巴細胞，皮質增厚，皮質與髓質間界限明晰，細胞形態(tài)規(guī)整，表明蘆薈多糖可降低小鼠胸腺淋巴細胞的衰老性減少，發(fā)揮抗衰功效[15]；黃芪多糖可升高小鼠的脾臟重量與脾臟指數，并使睡眠被剝奪小鼠的動脈周圍淋巴鞘厚度升高至正常水平，表明黃芪多糖可有效改善小鼠的脾組織結構[16]；天門冬多糖可緩解由環(huán)磷酰胺誘導的小鼠免疫器官組織結構損傷，使其胸腺內皮質區(qū)增大、髓質區(qū)減小，并顯著提升脾臟指數[17]；丹參多糖則可上調免疫功能低下小鼠的胸腺指數與脾臟指數，并可使糖尿病小鼠脾臟動脈周圍淋巴鞘變厚，淋巴細胞排列更為緊密[18-19]。上述研究充分反映了多糖作為免疫增強劑對組織器官的保護效果。在本研究中，添加了200 mg/kg白術多糖后，小鼠胸腺重量與胸腺指數比對照組顯著升高，胸腺皮質相對較厚，淋巴細胞數量較多，皮質與髓質間的界限清晰，表明白術多糖在適宜濃度下可促進免疫細胞的增殖，從而促進胸腺的發(fā)育。灌服白術多糖后，小鼠脾臟重量與脾臟指數同樣顯著上調，脾臟組織內動脈周圍淋巴鞘相對增厚，淋巴細胞密集分布，脾臟結構更為完善。此外，100 mg/kg組相比于對照組無明顯變化；而600 mg/kg組的作用效果不佳，其中淋巴細胞相對較少，細胞排列較為疏松，可能是因白術多糖的濃度過高會對組織產生一定的不良影響。這與李鵬等[20]研究獲得的白術多糖濃度在250 mg/kg～500 mg/kg時可增強小鼠脾臟內單核巨噬細胞的免疫活性的結果相似。Ren Z等[21]的研究結果表明，200 mg/kg和400 mg/kg劑量的大葉貫眾多糖對環(huán)磷酰胺誘導的免疫抑制小鼠有較好的免疫調節(jié)作用，而100 mg/kg的劑量效果不明顯；王向濤等[22]研究則反映，中高劑量的龍葵多糖可明顯提升S180荷瘤小鼠的胸腺與脾臟指數，但高劑量組荷瘤小鼠的生存時間及抑瘤率不如中低劑量組，其中中劑量組的抑瘤效果最佳。由此可見，多糖在合適的劑量下可更為有效的增強機體的免疫應答能力，抵御機體內外環(huán)境中的不良影響。本研究結果表明，白術多糖濃度為200 mg/kg時可更好的發(fā)揮其免疫調節(jié)作用，提升小鼠的胸腺與脾臟指數，促進胸腺與脾臟結構和功能的完善。

同一基因內上標小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，小寫字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)

同一基因內上標小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，小寫字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)

p38是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員之一，在細胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡和細胞間功能同步等多種過程中發(fā)揮重要作用[23]。ASK1為p38/MAPK信號通路最上游與調控細胞凋亡相關的MAPKKK類激酶，可平衡和整合細胞的應激反應并作出合適應答。ASK1受相應刺激致磷酸化后可促進MKK3/6基因表達，并促其表達的蛋白磷酸化從而誘導p38 MAPK基因轉錄，活化的p38 MAPK可將MSK1/2磷酸化，進一步調節(jié)細胞反應[24]。有研究者將小鼠脾臟巨噬細胞用p38/MAPK抑制劑處理后再予以輕度刺激，處理過的巨噬細胞與未經處理的相比較，其吞噬、趨向及殺傷能力大幅減弱，表明脾臟的免疫調節(jié)能力因p38/MAPK信號通路未能激活而有所下降[25]。還有研究證明，TNF-α與IL-1可激活p38/MAPK并激活胸腺細胞內AP-1、NF-AT及NF-κB的轉錄，故p38/MAPK可調控胸腺細胞的成熟和分化[26]。此外，Li Q等[27]發(fā)現富硒食用茹多糖可能通過作用于多條MAPK信號通路提升小鼠血清中丙二醛含量及抗氧化酶類的活性。劉晶等[28]也研究發(fā)現，米糠多糖可通過MAPK信號通路緩解由葡聚糖硫酸鈉引起的小鼠結腸炎，并抑制脾臟水腫和炎癥反應?？梢姡琈APK信號通路在多糖免疫調節(jié)機制中發(fā)揮了關鍵作用。本研究中，200 mg/kg組小鼠的胸腺與脾臟組織中p38/MAPK信號通路相關的關鍵基因表達量均有一定程度的升高，并且該濃度白術多糖對p38/MAPK級聯反應途徑中處于下端的激酶MSK1/2有較為明顯的正向促進作用；而白術多糖濃度為100 mg/kg時，可能因劑量過低而作用效果不明顯；濃度為600 mg/kg時，則可能因濃度過高對機體產生負性調節(jié)作用。本研究結果也表明，當濃度白術多糖為200 mg/kg時可更好的激活p38/MAPK信號通路，進一步調節(jié)細胞反應。結合小鼠的胸腺和脾臟指數變化以及組織切片觀察結果，進一步說明灌服200 mg/kg白術多糖，可促進小鼠免疫器官中免疫細胞的增殖，從而提升機體的免疫機能。

在200 mg/kg濃度下，白術多糖作為外來刺激原能激活小鼠胸腺與脾臟組織細胞的p38/MAPK信號通路，提高相關基因的表達量，促進淋巴細胞的增殖，從而促進免疫器官發(fā)育、改善免疫器官的結構與功能，提高機體的免疫應答能力。