陶偉杰，段笑笑，趙 輝，劉佳卉，趙遠(yuǎn)，單 虎，張傳美*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109；2.青島市動物疫病預(yù)防控制中心，山東青島 266000；3.齊魯動物保健品有限公司，山東濟南 250100)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，HPS)屬于巴斯德菌科嗜血桿菌屬，是一種革蘭氏陰性、具有多種不同形態(tài)的條件性致病菌，會引起纖維素性多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、 心包炎為主要病理特征的格拉澤氏病(Glasser’s disease)，主要引起2周齡到16周齡的豬發(fā)病。研究表明，副豬嗜血桿菌最易感染斷奶仔豬，其次是育肥豬和母豬[1]。副豬嗜血桿菌有15個以上的血清型，各血清型之間的致病力存在很大差異，其中血清1型、5型、10型、12型、13型和14型具有高致病性，2型、4型、15型有中等毒力，8型為弱毒力型，3型、4型、7型、9型、11型被認(rèn)為沒有毒力[2-3]，除此之外還有部分毒株為分子分型非典型(molecular serotyping non-typable，MSNT)分離株[4]。

研究表明，在2005年至2019年期間，中國HPS的總體流行率為27.8%，2011年至2015年的流行率最高，全國各地均有發(fā)生HPS感染現(xiàn)象，證明副豬嗜血桿菌感染在中國的豬群中普遍存在[5]。實際生產(chǎn)中副豬嗜血桿菌感染多呈慢性經(jīng)過，且在發(fā)生發(fā)展過程中常伴隨與豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型等混合感染，給臨床診斷和防治帶來困難，對豬場生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。有效的防控措施和合理的臨床用藥必須建立在準(zhǔn)確診斷及藥敏試驗的基礎(chǔ)上，因此本研究對1例疑似副豬嗜血桿菌感染的仔豬進(jìn)行了細(xì)菌分離鑒定、藥敏試驗和致病性試驗，為副豬嗜血桿菌病的臨床診治提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 2020年7月，山東某豬場部分仔豬和青年豬出現(xiàn)消瘦、嘔吐、關(guān)節(jié)腫大，發(fā)病后，用磺胺類藥物進(jìn)行治療，隨后病豬出現(xiàn)腹瀉并且有豬死亡，自開始死亡至今的病死率為12%，該場送檢2頭病豬到青島農(nóng)業(yè)大學(xué)教學(xué)動物醫(yī)院進(jìn)行診斷。該場發(fā)病仔豬未免疫接種任何疫苗。剖檢發(fā)現(xiàn)，胸腔和腹腔有纖維素性滲出，肺臟實質(zhì)性病變，喉頭出血，心包積液，脾邊緣出血，膀胱積尿，腎臟有出血斑，胃有出血點，胃底潰瘍，回盲口潰瘍，腸系膜淋巴結(jié)腫大，關(guān)節(jié)有積液。

采集剖檢豬的肺臟、脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體等部位的病變組織，采用國家標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行豬常見病毒病的PCR檢測:流感病毒(GB/T 27521-2011)、豬瘟病毒(GB/T 16551-2008)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(GB/T 18090-2008)、豬圓環(huán)病毒(GB/T 21674-2008)、偽狂犬病病毒(農(nóng)業(yè)部1485號公告-2-2010)。結(jié)果顯示，豬圓環(huán)病毒陽性，偽狂犬病病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒均陰性。

1.1.2 試劑 2×T5 Super PCR Mix(Colony)，擎科生物公司產(chǎn)品；TIANamp Virus DNA/RNA提取試劑盒，天根生化科技公司產(chǎn)品；DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000，TaKaRa公司產(chǎn)品；GoldView Ⅰ型核酸染色劑、NAD，Solarbio公司產(chǎn)品；新生小牛血清，HyClone公司產(chǎn)品；胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基、革蘭氏染色液試劑盒，海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；微生物藥敏試紙(K-B法)，溫州市康泰生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 儀器設(shè)備 顯微鏡，德國Leica公司產(chǎn)品；DHP-9272 電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；ZQPW-70 全溫振蕩培養(yǎng)箱，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；S0200-230V-EU 渦旋混合器，美國Labnet公司產(chǎn)品；HH-4 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司產(chǎn)品；SIGMA 3K15 離心機，德國Sigma公司產(chǎn)品；BSC-1100-LIA2 生物安全柜，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；K8360 自動凝膠成像系統(tǒng)，北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司產(chǎn)品；T100 PCR 儀，美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；PowerPac Basic 電泳儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離 根據(jù)臨床癥狀和剖檢變化，選取病豬的肺、脾、膝關(guān)節(jié)內(nèi)積液，于含有50 mL/L胎牛血清、10 mg/mL NAD的瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離。于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2條件下培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征。挑取單個菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.2 16S rRNA的PCR檢測及測序分析 取單菌落接種于含50 mL/L胎牛血清、10 mg/mL NAD的肉湯培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)(200 r/min)12 h，使用細(xì)菌核酸提取試劑盒提取細(xì)菌核酸，置-20 ℃保存?zhèn)溆?，作為PCR擴增的DNA模板。

參考文獻(xiàn)中的方法[6]，擴增細(xì)菌16S rRNA，目的片段1 428 bp。PCR擴增體系25 μL:2×T5 DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 8 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2.5 μL。擴增程序:98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃ 10 s，54 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳鑒定，擴增產(chǎn)物由擎科生物公司測序。測序結(jié)果由NCBI網(wǎng)站在線Blast比對分析。

1.2.3 套式PCR 根據(jù)副豬嗜血桿菌國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法(GB/T 34750-2017)進(jìn)行特異性PCR檢測，PCR擴增體系25 μL:2×T5 DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板2 μL。第一次擴增程序:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 60 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。第二次擴增程序退火溫度為54 ℃，其他程序同第一次擴增程序。PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.4 血清分型PCR 根據(jù)參考文獻(xiàn)[7],由擎科生物公司合成14個HPS血清型基因引物(表1)。

表1 血清型基因引物

PCR擴增體系25 μL:2×T5 DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 10 μL，上、下游引物各0.25 μL，DNA模板2 μL。擴增程序:94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，共30個循環(huán)；68 ℃終延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.5 多位點序列分型(MLST) 參照Mullins M A等[8]建立的HPS MLST分型方法。由擎科生物公司合成7個HPS基因型引物(表2)。PCR擴增體系25 μL：2×T5 DNA聚合酶12.5 μL，ddH2O 10.25 μL，上、下游引物各0.5 μL，DNA模板1.25 μL。擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95℃ 60 s，45 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR產(chǎn)物由擎科生物公司測序。將菌株的7個基因位點的序列與HPS MLST 數(shù)據(jù)庫(http://pubmlst.org/hparasuis)比對，獲得該菌株的MLST序列類型編號(即 ST 型)。

表2 MLST基因型引物

1.2.6 藥敏試驗 無菌條件下，采用紙片擴散法檢測分離菌株對12種藥物的敏感性。取搖菌后12 h的菌液100 μL均勻涂布在瓊脂培養(yǎng)基上，夾取12種藥敏紙片放置于適當(dāng)?shù)奈恢茫p輕按壓固定。倒置放于CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h。反復(fù)3次測定抑菌環(huán)的直徑取平均值，判斷藥物敏感性[2]。

1.2.7 動物致病性試驗 參照文獻(xiàn)[9]，將20只SPF小鼠隨機分為A、B、C、D共4組，每組5只，其中A、B、C組為感染組，D組為對照組。菌落計數(shù)后對3組感染組小鼠腹腔注射菌懸液(分別為A:1×108CFU/mL，B:1×109CFU/mL，C:1×1010CFU/mL)，0.2 mL/只，D組腹腔注射等劑量PBS。自注射前1 d至注射后5 d內(nèi)，觀察小鼠的飲食情況、臨床癥狀及體重，并對死亡小鼠進(jìn)行剖檢和細(xì)菌分離。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離

接種膝關(guān)節(jié)內(nèi)積液的培養(yǎng)基上觀察到針尖大小的半透明且光滑濕潤的菌落(圖1A)。革蘭氏染色鏡檢發(fā)現(xiàn)紅色的革蘭氏陰性細(xì)菌，呈球桿狀(圖1B)。

2.2 16S rRNA 基因的PCR檢測及測序分析

PCR檢測結(jié)果表明,得到1 428 bp的條帶，與預(yù)期片段一致(圖2)。測序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站在線Blast比對分析，與其同源度最高的菌株登錄號為CP049089.1，菌株為副豬嗜血桿菌。

A.培養(yǎng)特征;B.革蘭氏染色(1 000×)

2.3 套式PCR

特異性套式PCR產(chǎn)物分別為820 bp、312 bp，與預(yù)期片段一致，確定菌株為副豬嗜血桿菌(圖3)。

2.4 血清分型PCR

HPS血清型的PCR擴增得到490 bp的條帶，為血清型7型，其余均為陰性(圖4)。

2.5 MLST

MLST結(jié)果表明,得到7條不同長度的條帶，與預(yù)期片段一致(圖5)。得到等位基因編號分別為7、2、61、3、81、3、21，其中mdh的基因編號61為新出現(xiàn)的等位基因編號。ST 型編號為400。

2.6 藥敏試驗

對分離菌株紙片擴散法藥敏試驗的結(jié)果表明，分離菌株對頭孢曲松、阿莫西林/棒酸、慶大霉素、壯觀霉素、多西環(huán)素、甲氧芐啶/磺胺甲惡唑、左氟沙星、環(huán)丙沙星、氟苯尼考、多黏菌素B敏感，對亞胺培南、林可霉素高度耐藥(表3)。

表3 藥敏試驗結(jié)果

2.7 動物致病性試驗

各組小鼠均未出現(xiàn)死亡，感染組小鼠出現(xiàn)精神萎靡癥狀。注射細(xì)菌量為1×1010CFU/mL的感染組小鼠在1 d內(nèi)出現(xiàn)體重的下降，在隨后幾天內(nèi)逐漸恢復(fù)。在5 d時剖檢了2只1×1010CFU/mL的感染組小鼠，剖檢后發(fā)現(xiàn)有1只小鼠肺部出血，其他3只小鼠及對照組小鼠在5 d～6 d內(nèi)體重均略微增長。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.菌株

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000;1.fun Q(7型)基因

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;-.陰性對照； 1、2.菌株

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.atpD(614 bp)； 2.infB(470 bp)； 3.mdh(469 bp)； 4.rpoB(425 bp)； 5.6pgd基因(668 bp)； 6.g3pd(537 bp)； 7.frdB(553 bp)

3 討論

副豬嗜血桿菌是在于豬上呼吸道的一種常見的條件致病菌，當(dāng)豬群中存在豬繁殖與呼吸綜合征病毒或豬圓環(huán)病毒時,更易發(fā)生副豬嗜血桿菌病。該病原呈世界性分布，在中國、澳大利亞、美國、英國等世界多國普遍流行，各地流行菌株血清型不一，主要引起豬的多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦膜炎，發(fā)病日齡主要集中在斷奶和保育階段的仔豬，對國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失[10]。

本病例中仔豬發(fā)生了豬圓環(huán)病毒和副豬嗜血桿菌的混合感染，臨床癥狀表現(xiàn)復(fù)雜，僅依靠臨床和剖檢診斷無法確診，需要依靠實驗室診斷。在實驗室診斷中，PCR檢測較血清學(xué)檢測可以更快速、方便地檢測副豬嗜血桿菌，本試驗通過16S rRNA的PCR檢測和套式PCR檢測確診仔豬感染副豬嗜血桿菌。除此之外，對于豬場或存在多種血清型的情況，PCR可以快速檢測血清型，操作簡單，容易普及推廣，適用于臨床快速檢測診斷和流行病學(xué)調(diào)查[11]。目前，仍存在不能血清型分型的菌株，因此通過更精確的基因分型，更有助于分析病原的流行規(guī)律，其中，MLST可以通過管家基因間的基因變異來反映菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，提供更多的關(guān)于DNA方面的信息，有助于尋找基因型與毒力以及交叉免疫力之間的關(guān)系[7]。

近幾年來，最常見的血清型為7型、5/12型、4型、13型[4，12-13]。在以前的研究中，認(rèn)為血清型7型的菌株是無毒株，不產(chǎn)生臨床癥狀和生產(chǎn)損害，在本次病例中，血清型7型的菌株表現(xiàn)出一定的毒力，表現(xiàn)出胸腔和腹腔有纖維素性滲出、消瘦、關(guān)節(jié)積液等臨床癥狀。致病性試驗中，菌株在較高的濃度下才對小鼠體重有一定影響，小鼠均未死亡，證明菌株的毒力很弱。據(jù)臨床病料信息統(tǒng)計，副豬嗜血桿菌易與豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬圓環(huán)病毒混合感染[14]。豬圓環(huán)病毒病是一種免疫抑制性疾病，感染后會降低機體的免疫力，因此在臨床上極易導(dǎo)致與其他病原并發(fā)或繼發(fā)感染，從而加重病情、提高死亡率。本次病例的病豬同時感染了豬圓環(huán)病毒并表現(xiàn)出臨床癥狀，推測副豬嗜血桿菌在豬圓環(huán)病毒的影響下表現(xiàn)出更強的致病性。除了混合感染的影響外，因為副豬嗜血桿菌屬于細(xì)菌性疾病，受飼養(yǎng)管理的影響比較大，所以飼養(yǎng)管理也是影響副豬嗜血桿菌表現(xiàn)出臨床致病性的可能原因之一[10]。副豬嗜血桿菌慢性、持續(xù)性感染對豬組織器官產(chǎn)生損傷，增加豬群死淘率，降低生長速度和飼料報酬，對仔豬生產(chǎn)性能產(chǎn)生極顯著的影響[15]。因此，本研究表明在一些特殊條件(飼養(yǎng)條件不良或者有混合感染)下，血清型7型可能會使豬群表現(xiàn)出相應(yīng)的臨床癥狀。

研究發(fā)現(xiàn)，副豬嗜血桿菌對林可霉素、青霉素等有較高耐藥性[16]，對頭孢類敏感的菌株比較普遍[17]。本試驗中的藥敏結(jié)果與之一致，可選擇頭孢曲松、氟苯尼考等敏感的藥物配合使用，能夠很好的控制該病，降低耐藥菌株產(chǎn)生的風(fēng)險。除此之外，還要注意飼養(yǎng)環(huán)境的衛(wèi)生、消毒和通風(fēng)，增強防治措施，及時合理制定免疫程序。但是，如今市售的大多數(shù)疫苗都是滅活疫苗，具有血清型特異性，對病原血清型具有有限的交叉保護(hù)作用，需要進(jìn)一步研究毒力因子和開發(fā)新的疫苗[18-19]。