樊新麗，鄭會(huì)珍，翟雪潔，范士龍，馬 英，陳宋琴，韋麗婷，劉一凡，巴音查汗，張 楊

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 保存于新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室的牛環(huán)形泰勒蟲陽(yáng)性DNA。

1.1.2 主要試劑 pET-28a(+)及pEGFP表達(dá)載體，由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲實(shí)驗(yàn)室提供；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、Hind Ⅲ、DNA Marker、大腸埃希氏菌DH5α及BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、PMD18-T，TaKaRa公司產(chǎn)品；PCR產(chǎn)物回收試劑盒，Sigma公司產(chǎn)品；膠回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒，QINGEN公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

1.1.3 主要儀器 離心機(jī)(Cence?H1650)，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司產(chǎn)品；電子天平(METTLER TOLEDO)，梅特勒一拖力多(上海)儀器公司產(chǎn)品；DK-600A型電熱恒溫培養(yǎng)箱，一恒科學(xué)儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；PCR儀，美國(guó)伯樂(Bio-Rad)公司產(chǎn)品；DYY-Ш-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電儀，北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1TaAMA1目的基因擴(kuò)增 按照GenBank中發(fā)表的牛環(huán)形泰勒蟲AMA1基因的序列(登錄號(hào)：ANW48430.1)，使用Primer5軟件設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物。引物序列設(shè)計(jì)及合成如表1，以牛環(huán)形泰勒蟲陽(yáng)性DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸8 min。PCR產(chǎn)物在10 g/L瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，按照QIAGEN生物技術(shù)有限公司DNA片段純化試劑盒要求回收目的片段，置-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列及酶切位點(diǎn)

1.2.2 構(gòu)建重組pMD18-T-AMA1質(zhì)粒及驗(yàn)證 將回收產(chǎn)物與pMD18-T連接，連接反應(yīng)體系如表2?；靹蚝?，放于4 ℃，連接12 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸埃希氏菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)克隆菌進(jìn)行驗(yàn)證并送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表2 連接反應(yīng)體系

1.2.3 構(gòu)建重組pET-28a-AMA1和pET-28a-AMA1表達(dá)質(zhì)粒及驗(yàn)證 將回收的PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pET-28a及pEGFP分別經(jīng)內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ于37 ℃雙酶切1 h后電泳驗(yàn)證，試劑盒回收酶切PCR純化產(chǎn)物和質(zhì)粒載體pET-28a及pEGFP，在T4連接酶作用下按比例混合16 ℃連接過(guò)夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸埃希氏菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。將初步鑒定正確的陽(yáng)性克隆菌送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，并通過(guò)NCBI中Blast進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.4 獲得蛋白序列及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹 使用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，以測(cè)序比對(duì)結(jié)果搜索得到TaAMA1蛋白的氨基酸序列信息。以測(cè)定蛋白序列利用BlastP搜索模式生物如雙芽巴貝斯蟲(JN572801.1)、牛巴貝斯蟲(QDK56771.1)、吉氏巴貝斯蟲(ACY07255.1)、卵形巴貝斯蟲(AKR16110.1)、東方巴貝斯蟲(AHW45797.1)、惡性瘧原蟲(AFM28827.1)、莫氏巴貝斯蟲(QKY59678.1)、分歧巴貝斯蟲(ACC96234.2)、小泰勒蟲(XP-766171.1)、馬泰勒蟲(XP-004833099.1)、田鼠巴貝斯蟲(XP-021338488.1)，獲得TaAMA1在不同物種中的同源蛋白序列。使用DNA Star軟件中的Protean程序分析同源性，用Mega 7.0軟件中的Neighbor-Joining(NJ)A方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，Boot-strap分析重復(fù)數(shù)設(shè)置為1 000。

1.2.5 理化性質(zhì)分析、抗原表位及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 利用生物學(xué)信息分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行TaAMA1氨基酸理化性質(zhì)(分子式、分子質(zhì)量、酸堿性、等電點(diǎn)和穩(wěn)定性)、親/疏水性、信號(hào)肽、跨膜區(qū)域、磷酸化位點(diǎn)、抗原表位、亞細(xì)胞定位分析，各軟件網(wǎng)址和用途見表3。

表3 各軟件網(wǎng)址和用途

1.2.6 蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 用SOPMA在線預(yù)測(cè)軟件(https://npsaprabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred-sopma.pl)預(yù)測(cè)牛環(huán)形泰勒蟲AMA1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1月17日，水利部召開全國(guó)水利系統(tǒng)黨風(fēng)廉政建設(shè)工作視頻會(huì)議，貫徹落實(shí)黨的十八屆三中全會(huì)、十八屆中央紀(jì)委三次全會(huì)和習(xí)近平總書記重要講話精神，總結(jié)水利系統(tǒng)2013年黨風(fēng)廉政建設(shè)和反腐敗工作，部署2014年工作。水利部黨組書記、部長(zhǎng)陳雷強(qiáng)調(diào)，要緊密團(tuán)結(jié)在以習(xí)近平同志為總書記的黨中央周圍，標(biāo)本兼治、懲防并舉，銳意進(jìn)取、扎實(shí)工作，大力推進(jìn)水利系統(tǒng)黨風(fēng)廉政建設(shè)和反腐敗工作，為水利改革攻堅(jiān)和跨越發(fā)展提供堅(jiān)強(qiáng)有力的保障。水利部黨組副書記、副部長(zhǎng)矯勇主持會(huì)議，黨組成員、中紀(jì)委駐部紀(jì)檢組組長(zhǎng)董力作工作報(bào)告，部領(lǐng)導(dǎo)胡四一、劉寧、李國(guó)英、蔡其華、周學(xué)文，總工程師汪洪出席會(huì)議。

2 結(jié)果

2.1 牛環(huán)形泰勒蟲AMA1基因PCR擴(kuò)增

擴(kuò)增產(chǎn)物大小為828 bp(圖1)，與預(yù)期的目的基因片段大小相一致。測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast比對(duì)，與牛環(huán)形泰勒蟲(KX231677.1)同源性為99.72%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1,2,3.AMA1基因PCR產(chǎn)物；4.陰性對(duì)照

2.2 牛環(huán)形泰勒蟲AMA1基因表達(dá)載體的構(gòu)建及驗(yàn)證

對(duì)TaAMA1進(jìn)行雙酶切，經(jīng)10 g/L瓊脂凝膠電泳，pET28a-AMA1酶切片段分別為5 369 bp和828 bp(圖2A)，pEGFP-AMA1酶切片段分別為3 355 bp和828 bp(圖2B)，經(jīng)Blast比對(duì)，與牛環(huán)形泰勒蟲(KX231677.1)同源性為99.72%，說(shuō)明原核真核表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 AMA1生物信息學(xué)分析

2.3.1 牛環(huán)形泰勒蟲AMA1同源性分析及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 由圖3和圖4可知克隆所得TaAMA1基因氨基酸序列與小泰勒蟲(Thelieriaparva)同源性最高(69.9%)，遺傳距離最近，位于同一個(gè)分支，與馬泰勒蟲(Thelieriaequi)的同源性稍微遠(yuǎn)，與惡性瘧原蟲(Plasmodiumfalciparum)序列同源性相差更大。

M1.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 15 000；M2.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000； A：1,3.pET-28a-AMA1未酶切；2,4.pET28a-AMA1經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切； B：1,3.pEGFP-AMA1未酶切；2,4.pEGFP-AMA1經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ雙酶切

圖3 不同物種AMA1基因核酸序列同源性比對(duì)分析

2.3.2 理化性質(zhì)、信號(hào)肽及跨膜區(qū)域 利用ExPASy網(wǎng)站在線軟件對(duì)TaAMA1蛋白的理化特性進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，TaAMA1基因編碼蛋白分子式為C1 331H2 134N398O413S4，原子總數(shù)4 280，氨基酸數(shù)量為276，分子質(zhì)量為30.448 ku，理論等電點(diǎn)為9.94，屬于堿性蛋白；帶負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)總數(shù)為24，帶正電荷殘基(Arg+Lys)總數(shù)為41；在體外培養(yǎng)哺乳動(dòng)物網(wǎng)織細(xì)胞內(nèi)半衰期估計(jì)是7.2 h，不穩(wěn)定系數(shù)為37.93(標(biāo)準(zhǔn)40以下為穩(wěn)定蛋白)，屬于穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為70.62，親水性總平均值為-0.705，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白；由ProtScale在線軟件預(yù)測(cè)得知，TaAMA1蛋白的親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，親水性預(yù)測(cè)分析進(jìn)一步印證了GRAVY值分析的結(jié)果，TaAMA1屬于親水蛋白。通過(guò)TMHMM Server v.2.0在線發(fā)現(xiàn)，該蛋白未見到跨膜信號(hào)，因此該蛋白不屬于跨膜蛋白。經(jīng)信號(hào)肽預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)，TaAMA1序列中不包含信號(hào)肽(圖5)。

●本文測(cè)定

2.3.3 磷酸化位點(diǎn) 利用Net-Phos3.1 Server網(wǎng)站在線軟件對(duì)TaAMA1蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，TaAMA1蛋白氨基酸序列上共有38個(gè)磷酸化位點(diǎn)，包括26個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，10個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)絡(luò)氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖6)。表明TaAMA1蛋白共存在38個(gè)潛在的翻譯后修飾(post-translation modification,PTM)。

圖6 牛環(huán)形泰勒蟲AMA1蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)

2.3.4 B細(xì)胞抗原表位分析 采用DNA Star程序中Protean軟件預(yù)測(cè)AMA1蛋白B細(xì)胞抗原表位，結(jié)果見圖7。由圖7可知，該蛋白屬于親水性蛋白，柔韌性較好；抗原性及表面可及性較高。因此，將AMA1蛋白柔韌性、疏水性、表面可及性及抗原指數(shù)進(jìn)行綜合分析，再結(jié)合在線軟件IEDB分析預(yù)測(cè)該蛋白含有9個(gè)潛在抗原表位，結(jié)果見圖8和表4。

表4 牛環(huán)形泰勒蟲AMA1的B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

圖7 Protean預(yù)測(cè)牛環(huán)形泰勒蟲AMA1蛋白B細(xì)胞表位

圖8 IEDB預(yù)測(cè)牛環(huán)形泰勒蟲AMA1蛋白B細(xì)胞表位

2.3.5 亞細(xì)胞定位 為進(jìn)一步揭示TaAMA1在細(xì)胞中發(fā)揮功能的部位，經(jīng)PSORTⅡ預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，此蛋白定位于細(xì)胞核的可能性為87%，位于線粒體、細(xì)胞骨架及細(xì)胞質(zhì)中可能性為4.3%。

A.親疏水性分析；B.跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；C.信號(hào)肽預(yù)測(cè)

2.3.6 二級(jí)結(jié)構(gòu) 應(yīng)用SOPMA軟件預(yù)測(cè)TaAMA1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，TaAMA1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈分別占23.91%、7.61%、49.64%、18.84%(圖9)。

圖9 牛環(huán)形泰勒蟲AMA1蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

3 討論

生物信息學(xué)是一門醫(yī)學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)、數(shù)學(xué)、物理學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)交叉的學(xué)科。與傳統(tǒng)的研究方法相比，生物信息學(xué)方法具有高效和低成本的特點(diǎn)，該方法已被廣泛應(yīng)用于分析預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的功能、結(jié)構(gòu)和其他生物學(xué)特性。牛環(huán)形泰勒蟲是一種細(xì)胞內(nèi)寄生蟲，至今無(wú)有效治療方法及預(yù)防疫苗。AMA1作為高度保守性蛋白，被選定為最有前景的疫苗候選抗原之一，由微線體分泌。微線體蛋白在蟲體入侵宿主細(xì)胞的早期發(fā)揮識(shí)別和黏附作用，是免疫原性極強(qiáng)的毒力因子。Deans J A等[13]首次從諾氏瘧原蟲(裂殖子頂端復(fù)合體)中發(fā)現(xiàn)AMA1，隨后AMA1在頂復(fù)門其他種中相繼發(fā)現(xiàn)。本研究成功克隆出AMA1基因，目的基因?yàn)?28 bp，與預(yù)期片段大小相一致，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28aAMA1及真核表達(dá)載體pEGFP-AMA1，預(yù)測(cè)TaAMA1基因編碼蛋白分子式為C1 331H2 134N398O413S4，原子總數(shù)4 280，氨基酸數(shù)量為276，分子質(zhì)量為30.448 ku，理論等電點(diǎn)為9.94，不穩(wěn)定系數(shù)為37.93，該蛋白為穩(wěn)定蛋白，脂肪系數(shù)為70.62，親水性總平均值為-0.705，預(yù)測(cè)該蛋白為親水性蛋白，無(wú)跨膜區(qū)及信號(hào)肽，為進(jìn)一步研究AMA1蛋白的功能奠定基礎(chǔ)。

化學(xué)修飾是蛋白質(zhì)加工的主要方式。前體蛋白常需要進(jìn)行一系列的翻譯后修飾才能成為具有功能的成熟蛋白。目前已知的翻譯后修飾多達(dá)400余種[14]，最常見的有磷酸化、糖基化、甲基化、乙基化、羥基化等。磷酸化是蛋白翻譯后修飾中最為廣泛的共價(jià)修飾形式，蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過(guò)程，調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、骨架調(diào)控、凋亡、新陳代謝等幾乎所有的生命活動(dòng)過(guò)程，并且可逆的蛋白質(zhì)磷酸化是目前所知的最主要的信號(hào)傳導(dǎo)方式[15]。通過(guò)生物信息學(xué)在線程序分析TaAMA1蛋白含有38個(gè)磷酸化位點(diǎn)，預(yù)示其在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的控制具有顯著作用，AMA1蛋白可以通過(guò)調(diào)節(jié)這些磷酸化位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)功能，同時(shí)提示該蛋白具有潛在的抗原表位。蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位分析有助于確定AMA1蛋白在牛環(huán)形泰勒蟲體內(nèi)的主要分布[16]。亞細(xì)胞定位分析顯示，AMA1位于細(xì)胞核的可能性最高(87%)，提示TaAMA1可能在細(xì)胞核中發(fā)揮作用。

抗原表位分析對(duì)研究蛋白質(zhì)的抗原性具有重要的參考價(jià)值。通過(guò)開展對(duì)抗原表位的研究，既可以了解抗原蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，揭示病原的致病機(jī)制和免疫機(jī)理，也可為研究表位疫苗做準(zhǔn)備。對(duì)蛋白質(zhì)的抗原表位鑒定有X線晶體衍射技術(shù)和氨基酸序列分析技術(shù)。前者雖可獲得最詳盡的信息，但費(fèi)時(shí)且價(jià)格昂貴。在抗原氨基酸序列分析的諸多方法中Jameson-Wolf 法是最常用的方法之一[17]。本研究采用Protean軟件結(jié)合在線軟件IEDB綜合分析TaAMA1蛋白的Jameson-Wolf 指數(shù)，預(yù)測(cè)TaAMA1蛋白具有9個(gè)抗原表位，提示其具有免疫原性?？乖砦皇堑鞍踪|(zhì)抗原性的基礎(chǔ)，正確而詳細(xì)地繪制蛋白質(zhì)抗原表位的圖譜，對(duì)疾病的診斷及預(yù)后判定、定點(diǎn)改造蛋白質(zhì)分子以降低蛋白質(zhì)藥物的免疫原性、設(shè)計(jì)疫苗分子結(jié)構(gòu)以及免疫干預(yù)治療等具有重要意義。

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)因其構(gòu)型及所處的位置和數(shù)量不同而表現(xiàn)出不同的功能[18]。對(duì)抗原表位有很大影響。α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)規(guī)則，不易變形，較難嵌合抗體，一般不作為抗原表位，其主要功能是作為蛋白質(zhì)骨架起穩(wěn)定作用。而蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)角及無(wú)規(guī)卷曲則比較松散，易于發(fā)生扭曲、盤旋并展示在蛋白的表面，成為抗原表位的可能較大[19]。TaAMA1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲、延伸鏈分別占23.91%、7.61%、49.64%、18.84%，其中無(wú)規(guī)則卷曲占比例最高(49.64%)，提示可能具有多個(gè)抗原表位。

本研究成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET28a-AMA1及真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-AMA1，同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示與小泰勒蟲氨基酸序列同源性最大，生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)有38個(gè)磷酸化修飾位點(diǎn)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)位于細(xì)胞核的比例為87%，B細(xì)胞抗原表位分析顯示該蛋白含有9個(gè)潛在抗原表位，二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示有多個(gè)抗原表位，可為后續(xù)AMA1是否可作為牛環(huán)形泰勒蟲候選疫苗分子及研究其結(jié)構(gòu)功能奠定基礎(chǔ)。。