朱佳源，譚周進，鄭 淘,2，肖嫩群

(1. 湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208； 2. 湖南中醫(yī)藥大學藥學院食品藥品工程系，湖南 長沙 410208)

抗生素相關性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea，AAD)是應用抗生素后引起的腹瀉，根據是否由特定病原菌引起，可分為感染AAD和非感染性AAD，感染性AAD的常見致病菌為艱難梭菌(CD,Clostridiumdifficile)。約5%～35%患者接受抗生素治療后發(fā)生AAD[1]，且隨著抗生素的廣泛使用，AAD的發(fā)病率呈現上升趨勢，其發(fā)病原因復雜多樣，目前認為AAD主要是由于抗生素的使用破壞了腸道微生態(tài)平衡所致[2]。

CD又名難辨梭狀芽孢桿菌，是一種多重耐藥性厭氧的條件致病菌，隨著艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection, CDI)的事件和嚴重程度顯著增加，已被公認為全球醫(yī)院AAD的主要病原體[3]。CD可通過形成孢子引發(fā)和傳播疾病，并導致疾病復發(fā)，復發(fā)率高達30%[4-5]。在結腸中，孢子萌發(fā)成營養(yǎng)細胞，在腸道主要產生毒素A(TcdA) 和毒素B(TcdB) ，以及艱難梭菌轉移酶毒素等[5]。研究[6]表明，AAD與CD感染相關，大量使用抗生素會引起腸道菌群失調，進而增加腸道氨基酸水平，抑制次級膽汁酸產生，為CD定植創(chuàng)造條件。此外CD還可通過結合纖溶酶原(hPLG)和抑制血紅素毒性促進腹瀉[7-8]。

AAD發(fā)病方式復雜多樣，其發(fā)病機制還有待進一步研究[5,9]。隨著高毒力菌株027和078的出現，以及克林霉素、頭孢菌素等抗生素的大量使用, 艱難梭菌相關腹瀉已成為全球關注的問題[10]。加拿大、美國以及一些歐洲國家多次出現CDI的暴發(fā)流行，給各國的醫(yī)療保健系統(tǒng)帶來沉重負擔。本文通過綜述AAD與CD相關的研究進展，旨在從CD的角度對AAD防治提供新的思路和方法，以期改進AAD的治療與預防。

1 CD是引起AAD的主要致病菌

CD是引起AAD的主要原因，其并發(fā)癥也存在不同程度的腹瀉(見表1)[11]。AAD患者發(fā)生CDI，抑制腸道內有益菌的生長，耐藥性CD過度增殖[3]。相比其他原因引起的腹瀉，CD致AAD有較為嚴重臨床癥狀，表現為結腸炎和假膜性腸炎而引起黏液、膿血便以及全身癥狀，嚴重感染可致死。因此，隨著抗生素的廣泛使用，不但要預防AAD的發(fā)生，更應該關注由CD引起的AAD。

表1 抗生素相關CDI并發(fā)癥及其臨床特征

2 CD致AAD的作用機制

2.1 腸道菌群失調 腸道菌群在病原體防御中起著關鍵作用，其組成和功能是宿主生物學的組成成分，健康的腸道菌群對宿主是有益的，而被破壞或者失衡的腸道菌群不利于宿主健康，表現為易感染，患慢性炎癥、自身免疫疾病和癌癥風險增加[6]。長期使用廣譜抗生素會導致腸道菌群失調，影響腸道內膽汁酸和氨基酸的水平，促進CD的定植。見表2。

表2 菌群失調對CD致AAD的作用機制

2.1.1 菌群失調對CD致AAD的作用 健康的腸道微生物能建立和維持對CD的定植抗性，而AAD患者腸道菌群很大一個特點就是菌群失調，且腸道代謝產物和腸道微生物群落結構都發(fā)生了改變，表現為抑制CD生長的代謝產物和腸道菌群多樣性減少，降低了腸道菌群對CD的定植抗性，而腸道內氨基酸(脯氨酸：CD生長能量來源之一)增加，為CD的定植創(chuàng)造了條件[6,13]。因此菌群失調可促進CD導致AAD的發(fā)生。

2.1.2 菌群失調促進CD致AAD的方式 腸道中的某些細菌可分泌色氨酸衍生的抗生素(1-乙?；?β-咔啉和turbomycin A)，兩種抗生素均可通過抑制CD分裂時隔膜的形成，抑制CD生長繁殖，次級膽汁酸(脫氧膽酸和石膽酸)可增強這些抗生素的抑制活性，菌群失調引起腸道內分泌次級膽汁酸菌群減少。因此菌群失調可以通過抑制次級膽汁酸的產生從而促進CD生長[15,6]。

CD可從氨基酸分解代謝中獲得能量，在低濃度次級膽汁酸條件下，氨基酸明顯促進CD的生長繁殖[15,10]。菌群失調引起腸道游離氨基酸(尤其是脯氨酸)含量增加，從而促進CD生長[10]。Battaglioli 等[6]將AAD患者腸道菌群移植給無菌小鼠，小鼠感染CD后，腸道氨基酸濃度增加，且CD易感性升高,而將健康人類糞便菌群移植到小鼠腸道內，游離脯氨酸的濃度降低，CD定植受到抑制。即菌群失調可以促進腸道氨基酸合成，為CD定植提供能量，提示可以通過調節(jié)人體對氨基酸的攝取，改善CD引起的AAD。

2.2 CD與AAD的相互作用 CD與AAD之間存在相互作用。研究[16-17]指出，使用抗生素導致腸道巨噬細胞對細菌刺激反應過度，產生過量的炎癥因子，同時改變腸道代謝組成，為CD創(chuàng)造有益的生長環(huán)境，且由于抗生素常見的副作用是腸道菌群失衡，腸道內抑制CD生長的物質和抑制色氨酸衍生的抗生素的菌群均減少，促進CD繁殖和毒素釋放，加重AAD的癥狀。且隨著一種高毒力流行菌株BI/NAP1/027的出現，以及廣譜抗生素的廣泛使用，特別是克林霉素、氟喹諾酮類和頭孢菌素，AAD的發(fā)病率顯著升高。

微生物對抗生素產生耐藥的情況很多，近年研究發(fā)現，一些微生物耐藥機制受到群體感應系統(tǒng)的調控。群體感應是指細菌細胞間可通過互相通信聯(lián)系以協(xié)調基因的表達,以群體的形式對不斷變化的環(huán)境條件作出反應。Darkoh等[18]發(fā)現CD毒素的產生主要受新型硫代內酯群體信號肽的控制，而這種肽獨立于tcdC基因的調控。毒素A和B受輔助基因調節(jié)劑(Agr)群體信號系統(tǒng)控制，Agr系統(tǒng)轉錄包含agrA，-B，-C和-D的四基因操縱子，agrB1和argD1基因座負責產生TI信號(肽硫代內酯AIP稱為TI信號)，TI信號是激活毒素產生硫代內酯信號肽所必須的[19]。AAD患者腸道的微生物群發(fā)生改變，促進耐藥的CD在腸道中增殖，并迅速形成細胞群后釋放TI信號，激活AgrA2和AgrC2兩組分系統(tǒng)，直接或間接誘導毒素基因發(fā)生轉錄，刺激毒素產生[20,13]。

細菌生物被膜是附著在生物或者非生物表面并由胞外基質所包裹的系統(tǒng)化、組織化的多細胞群落，對細菌有保護作用，能避免細菌受不利環(huán)境(如抗生素)的影響,此也是細菌對抗生素產生耐藥的原因之一[12]。研究發(fā)現，CD對抗生素產生耐藥可能是由于刺激了生物膜的形成，通過形成多層結構化生物膜提高CD的抗微生物能力，該生物膜的形成主要是由CD固有的機制驅動，但暴露于環(huán)境中抗生素的選擇性壓力也會刺激生物膜形成，然而，梭菌生物膜如何有助于CD獲得抗藥性的具體機制尚不十分清楚[20]。因此，濫用抗生素會加重CDI，在使用抗生素治療疾病時，應該預防CD感染。

2.3 CD與腸道菌群相互作用 CD引起的AAD抗藥性不能歸因于單一菌群作用，而是多種微生物以及與環(huán)境相互作用的結果。健康的腸道菌群能抑制CD生長，可以產生抑制CD的代謝產物，而腸道菌群失衡時促進CD的生長，如濫用抗生素改變了腸道菌群結構，主要表現為變形桿菌增加，擬桿菌和硬生菌種群減少，Porphyromonadaceae、乳桿菌和Alistipes等有益菌數量下降，大腸埃希菌和鏈球菌等有害菌增多，從而促進CD的高水平定植。腸道菌群的代謝產物改變也能夠影響CD的生長繁殖和發(fā)病機制，包括影響CD孢子萌發(fā)，營養(yǎng)物質攝取和毒素產生等過程[13]。由于多種菌群都表現出對CD的定植抗性，而有關抗生素、腸道菌群和CD之間相互作用的研究很少，因此需要進一步的研究[21]。

2.4 CD導致AAD的物質

2.4.1 細胞毒素A和細胞毒素B CD本身沒有侵襲性，主要通過分泌TcdA和TcdB致病，分別由基因tcdA 和tcdB 編碼，基因tcdC和tcdD調控，CDI患者存在tcdC部分堿基缺失和多態(tài)性，引起毒素A和毒素B的產生增加[21]。TcdA可以結合細菌DNA激活Toll樣受體9(TLR9)，TLR9可識別細菌DNA以促進炎癥反應，TcdA還可通過與腸道黏膜受體結合誘導固有層巨噬細胞產生白介素-1、6、8和α腫瘤壞死因子及環(huán)氧合酶-2，導致上皮細胞破裂壞死和單層腸上皮細胞的緊密連接斷裂，從而導致腹瀉[22,17]；TcdB可以刺激單核細胞釋放炎癥因子，直接破壞腸壁細胞, 引起炎癥反應進而使腸黏膜細胞變性、凋亡、壞死和脫落，導致腹瀉[23]。醫(yī)院腹瀉患者的臨床分離株通常同時產生毒素A和B，但是越來越多的報告提到毒素A陰性，毒素B陽性(A-/B+)菌株能引起嚴重感染[14]。此外，毒素刺激固有免疫細胞和中毒上皮細胞生成促炎因子和趨化因子，增強炎癥免疫應答，促進CDI[5,24]。

2.4.2 hPLG hPLG是纖溶酶的前體，是哺乳動物的絲氨酸蛋白酶之一，在纖維蛋白溶解、細胞遷移和組織重塑、基底膜和細胞外基質 (ECM) 的降解中起重要作用[7, 25]。hPLG在毒素誘導的腸道損傷部位表達，導致IL-1A、IL-1B、IL-3、IL-10、IL-12B、G-CSF、GM-CSF等細胞因子上調，促進組織降解，此外，CD的孢子可特異性結合hPLG及活化后的纖溶酶， 纖溶酶原被招募至腸道損傷部位并與CD的孢子表面結合，在被激活為纖溶酶后切割孢子表面蛋白以促進CD的孢子萌發(fā)，從而惡化CD誘導的腹瀉[7]。研究發(fā)現，抗纖溶酶抗體可有效抑制hPLG的激活，從而降低CDI，提示靶向纖溶酶原活化是治療CDI的潛在策略[7]。

2.4.3 血紅素 以往研究中，CDI患者胃腸腔裂解紅細胞中檢測到高濃度血紅蛋白，血紅素是血紅蛋白的含鐵原卟啉輔因子，在許多氧化還原反應中起到酶催化的作用，包括參與呼吸過程和抗氧化應[26,8]。血紅素對CD具有一定毒性，CD可通過HatRT外排系統(tǒng)減少毒性，但HatRT對CD定植和腸道內維持并不起作用，表明存在另外應對血紅素的機制[26]。研究發(fā)現，CD存在一個CD血紅素感應膜蛋白(HsmRA)系統(tǒng)，能通過轉錄因子HsmR和HsmA感知血紅素，轉錄因子HsmR通過結合血紅素激活HsmA，后者可降低血紅素毒性并利用血紅素降低氧化應激，從而促進CD在腸道內定植并賦予其對抗菌藥物的抗性，表明靶向HsmR或HsmA的藥物開發(fā)可用于CDI治療[8]。

3 CDI引起AAD的治療

3.1 非藥物治療

3.1.1 糞便菌群移植 糞便菌群移植是指將健康人糞便菌群移入患者腸道內，通過增加腸道定植抗性和恢復保護作用，抑制CD生長，此治療方法的優(yōu)點是快速、經濟、有效，并且有助于根除CD的抗生素耐藥菌株，是治療CDI和復發(fā)性CDI(rCDI)最有效的方法，一次治愈率高達91%。而對于患腫瘤及接受造血干細胞移植的青少年兒童，推薦使用各類抗生素治療，不推薦糞菌移植[27]。菌群移植能使患者的菌群趨向于供體菌群，重新恢復腸道菌群平衡和增加短鏈脂肪酸水平[28]。糞便移植可改善CDI的治療效果，但捐獻者菌群轉移到接受者的同時可能導致其他病原體的感染和傳播[29]。

3.1.2 益生菌 益生菌作為腸道菌群的一大類別，能夠通過抑制致病菌幫助機體維持腸道平衡，還可能刺激免疫系統(tǒng)防止病原體黏附和入侵，清除腸道中的病原體和毒素[30]。鮑氏酵母菌(S.boulardii) 是一種特異性酵母來源的益生菌，可通過上調TcdA的總抗體和特異性腸道抗體 (IgA)，或通過釋放一種蛋白酶水解CD毒素預防CDI[31-32]。分析8 000多份住院期間使用抗生素的患者資料發(fā)現，補充鮑氏酵母菌可降低CDI的發(fā)病率，且在使用抗生素后24 h之內補充效果更好[21,33]。臨床試驗證實，特定益生菌能預防AAD和CDI復發(fā)[34]。因此使用益生菌可以預防和改善CD引起的AAD。

3.1.3 靶向CD毒素制劑 CDI由分泌型蛋白毒素介導，其毒力由肌醇己糖磷酸(IP6) 變構激活其蛋白酶結構域后的細胞內自身蛋白水解調節(jié)。研究發(fā)現，TcdB進入細胞后發(fā)生構象變化，葡糖基轉移酶及鄰近的半胱氨酸蛋白酶結構域進入細胞質，此時胞內IP6作為變構激活劑觸發(fā)毒素自身蛋白發(fā)生水解，釋放出游離的葡糖基轉移酶[35]。腸道中的高濃度鈣離子可螯合IP6，CDI小鼠口服對鈣絡合敏感性降低的IP6類似物后，進入細胞葡糖基轉移酶減少，從而抑制了CDI引起的炎癥[35]。因此設計了一種在生理條件的鈣離子濃度下維持變構活性的IP6類似物，可抑制CDI，且靶向CD毒素能避免對細菌施加選擇性壓力，從而降低發(fā)生耐藥的可能性。

3.2 藥物治療 甲硝唑或萬古霉素是治療CDI腹瀉的常用藥，患者口服甲硝唑(500 mg, 每日3次或250 mg, 每日4次)和口服萬古霉素(125 mg，每日4 次)具有相似的效果，兩種藥物對輕癥感染者的治療無差異，但對于重癥患者，萬古霉素效果更好，甲硝唑能避免院內病例中產生耐萬古霉素腸球菌的風險[36-37]。近年來，國外相繼出現了耐甲硝唑和萬古霉素CD的報道，且發(fā)現使用這兩種藥物后復發(fā)率較高，約10%～40%的患者被改善后復發(fā)CDI[38]。

中醫(yī)在中國已經有3000多年的歷史，而且由于中藥資源豐富，成本低、副作用少等特點，已經逐漸獲得醫(yī)學界的認可，中西結合治療疾病在中國醫(yī)療體系中發(fā)揮著越來越重要的作用。在臨床實踐中,中藥治療AAD有很好的療效[39]。與使用安慰劑的小鼠相比，用中藥治療的CDI小鼠糞便中的毒素明顯減少[39]。研究發(fā)現，中藥小檗堿和萬古霉素聯(lián)合治療可以協(xié)同抑制CD生長和調節(jié)腸道菌群平衡，且能預防萬古霉素治療引起的CDI復發(fā)[40]。體外試驗證實，某些傳統(tǒng)中醫(yī)復方制劑可以抑制CD生長和毒素的產生，如在tcdA+tcdB+CD中，參苓白術散組和理中湯組對tcdA和tcdB基因的表達分別表現為顯著抑制和完全抑制；而對于tcdA-tcdB+CD, 兩種中藥復方制劑則完全抑制tcdB基因的表達[41]。因此，可以運用中藥復方制劑或中西藥相結合的方式治療CD導致的AAD。

4 總結

研究顯示，AAD發(fā)病率在全國乃至國外呈現逐年上升趨勢，且隨著高毒力菌株027和078的出現，CD的致病性和致死率提高，CDI的風險也顯著升高。AAD發(fā)病率的逐年增長可能與抗生素在國內外大量使用密切相關。隨著國內外醫(yī)院對抗生素的需求增加，抗生素濫用的現象屢見不鮮，應嚴格限制抗生素的使用量，同時改善腸道菌群失衡，預防CD所致AAD的發(fā)生[42]。近年來，圍繞AAD與CDI之間的研究已成為熱點，研究結果也證實了AAD與CD密切相關[18]。AAD患者存在菌群失調，表現為產生抑制CD生長物質和色氨酸衍生的抗生素菌群減少，腸道代謝產物次級膽汁酸的產生減少，而游離氨基酸含量增加，為CD的定植創(chuàng)造條件。CD主要通過分泌TcdA 和 TcdB 誘導AAD，也可以通過hPLG和血紅素促進CDI導致AAD的發(fā)生。糞便移植可以幫助機體恢復腸道菌群平衡，口服益生菌能夠抑制CD生長，西藥治療復發(fā)率高且易產生耐藥性，但相關中醫(yī)藥可以有效預防CDI的復發(fā)，中藥復方制劑在抑制CD生長和其毒素產生方面療效也十分顯著。

綜上所述，AAD發(fā)生與CD密切相關，研究AAD與CD之間的相關性有望從CDI的角度揭示AAD的發(fā)病機制。且由于AAD的發(fā)病方式復雜多樣，CD致AAD的相關機制還有待更深入的研究。全面和深入地了解CD與AAD之間的關系，可以為臨床更合理、有效的治療和預防CD導致的AAD提供參考。