賴亦靜 ，黃雪君，2，3 ，李鈺婷 ，彭莎 ，江潔怡，2，3 ，陳玉興，2，3，蔡大可，2，3，甘海寧，2，3

[1.廣州中醫(yī)藥大學第五臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510095；2.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院），廣東廣州 510095；3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東廣州510095]

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管病的基礎性病變，可引起缺血性心臟病、中風和外周血管疾病等心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）。CVD是發(fā)達國家的主要死亡原因[1]，而在發(fā)展中國家與CVD有關的死亡人數也在不斷增加。AS在2種最常見的CVD——心臟缺血和腦血管疾病[2]的發(fā)病機制中起著預先決定作用，因此阻止AS的發(fā)生與進展已成為心血管疾病防治的研究重點。20世紀以來，脂質積累被認為在AS發(fā)展中起主導作用，1999年Ross提出AS是一種慢性炎癥反應[3]，炎癥是AS發(fā)生發(fā)展過程中的重要推動力，越來越多的研究證明炎癥因子和炎癥小體在AS的炎癥反應中起著關鍵作用，其中以NLRP3（NOD-，LRR-，and PYD-containing protein 3）為代表的炎性小體備受關注。NLRP3炎癥小體是一種細胞內模式識別受體，當配體與NLRP3結合后促進炎癥小體的形成，并對caspase-1 進行自身激活，最終導致白介素-1β（interleukin-1 beta，IL-1β）和白介素-18（interleukin-18，IL-18）的成熟及分泌[4]，參與AS 的炎癥反應過程。課題組前期研究表明，穿心蓮內酯有減輕AS 炎癥反應、減緩主動脈斑塊形成的作用[5]。但穿心蓮內酯溶解性低，生物利用度低，課題組在對穿心蓮內酯結構修飾研究中發(fā)現其五元環(huán)內酯開環(huán)物穿心蓮酸的抗炎活性與穿心蓮內酯相當[6]，并能明顯影響caspase的表達[7]。本研究將基于NLRP3通路探討穿心蓮酸干預AS發(fā)生發(fā)展的作用，為AS的防治藥物研發(fā)提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥物與試劑

瑞舒伐他汀鈣片（rosuvastatin），阿斯利康藥業(yè)（中國）有限公司，批號： 134454；穿心蓮酸（andrographolic acid），廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院制備[7]。小鼠高脂飼料含76.5%標準飼料、0.5%膽酸鈉、5%蔗糖、3%膽固醇、10%豬油、5%蛋黃粉，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18 抗體，購自美國Proteintech。膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒、三酰甘油（triglyceride，TG）試劑盒、低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）試劑盒、高密度脂蛋白（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。

1.2 實驗動物

SPF 級ApoE-/-小鼠50 只，C57BL/6 小鼠10 只，雄性，5～6 周齡，體質量（22±2）g，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心，生產許可證號SCⅩK（粵）2018-0002。

1.3 主要儀器

BS224S 電子天平（1/萬）（德國SARTORIUS）；5418 型小型高速冷凍離心機（德國Eppendorf）；Varioskan Flash 型全波長多功能酶標儀（美國Thermo）；SmartSpec plus 核酸蛋白測定儀、miniprotean Teral Cell 垂直電泳槽、PowerPac Basic 電泳儀（美國Bio-Rad）；5200 Multi 多功能成像系統(tǒng)（上海Tanon）；BⅩ51顯微鏡（日本Olympus）。

2 方法

2.1 動物分組與造模

ApoE-/-小鼠適應性喂養(yǎng)1周后每籠小鼠每天定量給予高脂飼料20 g，連續(xù)8 周，C57BL/6 小鼠作為野生型對照組小鼠給予普通配合飼料。第8 周末，小鼠眼眶靜脈叢采血，按TC 水平將進食高脂飼料小鼠隨機分為5 組，每組10 只，分別為模型組、瑞舒伐他汀組、穿心蓮酸高、中、低劑量組。瑞舒伐他汀片臨床每日口服1 粒，相當于10 mg 瑞舒伐他汀，根據體表面積換算[8]小鼠等效劑量為1.3 mg/kg。根據前期實驗結果設置穿心蓮酸高、中、低劑量分別為25、12.5、6.25 mg/kg。

2.2 動物給藥及取材

從第8 周開始，各給藥組給予相對應藥物灌胃20 mL/kg，正常對照組和模型組給予等容量蒸餾水灌胃，每天1 次，連續(xù)8 周。末次給藥前12 h 禁食不禁水。末次給藥后1 h，小鼠眼眶靜脈叢取血，3 000 r/min離心10 min取血清，置于-80 ℃冰箱保存；取部分主動脈置于中性甲醛溶液固定，取另一部分主動脈置于液氮速凍后-80 ℃保存。

2.3 檢測指標

2.3.1 血脂水平 根據試劑盒說明書，檢測血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平。

2.3.2 主動脈病理形態(tài)檢測 將中性甲醛溶液固定的主動脈，按照常規(guī)方法制作石蠟切片，進行油紅O染色。染色前將切片在室溫下放置20 min，待載玻片上水汽消失后，油紅O 染液染色8 min，85%異丙醇洗15 s，蒸餾水洗1 min。蘇木精染色5 min，蒸餾水洗2 min，用水溶性封片劑封片，顯微鏡觀察主動脈斑塊變化。

2.3.3 Westernblot蛋白免疫印跡分析NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18 的表達 將RIPA 裂解液與PMSF、蛋白酶/磷酸酶抑制劑按照100∶1∶1（體積比）配制成濃度為含1%PMSF 及蛋白酶/磷酸酶抑制劑的組織裂解液，置于冰上預冷，現配現用。取出-80 ℃冰箱保存的小鼠主動脈，加入1 mL 組織裂解液，用電動勻漿器在冰上充分研磨后，放置10 min，4 ℃下12 000 r/min離心10 min。吸取上清液，棄去沉淀，按照BCA蛋白定量檢測試劑盒的方法，測定各樣品A值，計算每個樣品蛋白濃度。吸取調整后的蛋白樣品80 μL，加入20 μL 的5×上樣緩沖液，充分混勻后，100 ℃加熱5 min，使蛋白質充分變性。提取的蛋白經電泳、轉膜、封閉后，加入相應的一抗，4 ℃環(huán)境中孵育過夜后將膜取出，吸去一抗，洗滌3 次后加入相應的二抗，室溫搖床孵育90 min，80 r/min，吸去二抗，洗滌3 次后將PVDF 膜保存在PBST 洗滌液中，在暗室中將PVDF膜置于ECL發(fā)光顯影液中1～2 min，使用凝膠自動成像系統(tǒng)對PVDF 膜進行拍攝，并用Image J軟件對蛋白條帶灰度進行半定量分析，計算各組目的蛋白表達水平。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件，計量資料以表示，多組間均值比較采用單因素方差分析，先行Levene Statistic 方差齊性檢驗。方差齊時，采用SNK 檢驗進行組間均值兩兩比較；方差不齊時，采用Dunnett T3檢驗進行組間均值兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 穿心蓮酸對AS小鼠血脂水平的影響

與正常對照組比較，模型組TC、TG、LDL-C含量顯著性升高（P＜0.01），HDL-C 含量顯著性降低（P＜0.05）；與模型組比較，瑞舒伐他汀組和穿心蓮酸高、中、低劑量組TC 含量顯著性降低（P＜0.05），HDL-C含量顯著性升高（P＜0.05），瑞舒伐他汀組和穿心蓮酸高、中劑量組LDL-C 含量顯著性降低（P＜0.05），各給藥組TG 含量與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C含量Table 1 Level of Serum TC,TG,LDL-C,HDL-C in different groups(,n=10)c/(mmol·L-1)

表1 各組小鼠TC、TG、LDL-C、HDL-C含量Table 1 Level of Serum TC,TG,LDL-C,HDL-C in different groups(,n=10)c/(mmol·L-1)

與正常對照組比較：**P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05。

3.2 穿心蓮酸對AS小鼠主動脈病理學的影響

正常對照組小鼠主動脈壁厚薄均勻，主動脈內膜光滑平整，內膜各層結構正常，未發(fā)現明顯的動脈粥樣硬化病灶。模型組可見動脈管腔不平，管腔內膜增厚，斑塊明顯紅染，脂質浸潤斑塊增多明顯；瑞舒伐他汀組、穿心蓮酸高劑量組的主動脈壁各層結構正常，局部可見較小斑塊，病變程度明顯較輕；穿心蓮酸中、低劑量組的主動脈壁增厚，脂質浸潤斑塊明顯較多。見圖1。

圖1 各組小鼠主動脈病理學形態(tài)觀察（油紅O染色，40×）Figure 1 Histopathological changes in the aorta of mice in different groups(Oil red staining,40×)

3.3 穿心蓮酸對AS 小鼠主動脈NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18表達的影響

與正常對照組比較，模型組caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表達量顯著性升高（P＜0.05），NLRP3 蛋白表達量有升高趨勢但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，穿心蓮酸高、中、低劑量組NLRP3、caspase-1蛋白表達量顯著性降低（P＜0.05），穿心蓮酸高、中劑量組IL-1β、IL-18 蛋白表達量顯著性降低（P＜0.05），瑞舒伐他汀組caspase-1 蛋白表達量顯著性降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 各組小鼠主動脈NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達Figure 2 Protein expressions of NLRP3,caspase-1,IL-1β and IL-18 in the aorta of mice from each group(,n=3)

4 討論

高脂飼料喂養(yǎng)ApoE-/-小鼠建立AS 模型，脂質代謝出現紊亂，脂質在主動脈內膜下沉積并伴隨內膜增厚，發(fā)生炎性浸潤等。在本實驗中，模型組小鼠血清TC、TG、LDL-C 水平顯著升高，HDL-C 水平顯著降低，胸主動脈病理切片油紅O 染色顯示主動脈壁粗糙，內膜明顯增厚，斑塊增多，脂質明顯浸潤。穿心蓮酸干預后，血脂水平明顯改善，主動脈病變得到不同程度改善，穿心蓮酸高中低劑量血清TC 及LDL-C 水平顯著下降，HDL-C 水平顯著升高，穿心蓮酸高劑量組主動脈壁各層正常，斑塊較少，脂質浸潤明顯減輕，與瑞舒伐他汀組相近，表明穿心蓮酸可改善血脂水平，減輕AS小鼠主動脈病變。

脂質沉積和炎癥反應是動脈粥樣硬化的2個主要特征，兩者相互作用、互為因果共同構成了AS 的基本發(fā)病機制。AS 相關病變中并不存在微生物感染，其無菌炎癥主要是由炎癥小體活化。NLRP3炎癥小體是一種細胞內模式識別受體，當配體與NLRP3結合后促進炎癥小體的形成，NLRP3的配體主要是內源性的，膽固醇、脂蛋白、細胞壞死成分等都可以激活NLRP3炎癥小體在非感染情況下引發(fā)和維持慢性炎癥反應[9]。在動脈粥樣硬化發(fā)展的過程中，膽固醇是炎癥小體通路的重要激活劑，在疾病早期就發(fā)揮重要作用，膽固醇結晶可以通過激活巨噬細胞內的NLRP3 炎癥小體參與AS 的早期形成，其依賴于caspase-1 的激活促成IL-1β的釋放[10]。當配體與NLRP3蛋白的LRR 結構域結合后NLRP3被活化，暴露PYD，再通過PYD-PYD 相互作用與其接頭蛋白ASC 結合，由ASC 的CARD 結構域招募procaspase-1，形成炎癥小體，并對caspase-1進行自身激活，活化后的caspase-1 對pro-IL-1 和pro-IL-18 等底物進行切割，促進IL-1β和IL-18的成熟及分泌[11]。

大量研究證明了NLRP3炎性小體在人類心血管疾病中的突出作用，冠狀動脈粥樣硬化患者在大動脈的NLRP3表達比無癥狀斑塊患者顯著增加，NLRP3炎性小體信號通路包括NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18在大動脈中表達顯著增強，這與疾病嚴重程度及CVD 的危險因素有關[12-14]。有研究發(fā)現丹參酮ⅡA顯著降低體內及體外模型的NLRP3炎性小體的啟動和激活，從而改善了AS的病變程度[15]。本實驗結果顯示，AS模型小鼠胸主動脈NLRP3炎癥小體蛋白表達有升高趨勢，穿心蓮酸各劑量組可有效降低NLRP3炎癥小體表達。模型組NLRP3蛋白表達水平雖有升高，但差異無顯著性可能與不同動物模型有關，也可能受激活NLRP3的其他通路的影響[16]。

在動脈粥樣硬化斑塊中caspase-1的活化標志著炎癥小體的活化。caspase-1是主要的IL-1處理蛋白酶，作為酶原大量存在于造血細胞中，需要炎癥小體的激活。IL-1β前體pro-IL-1β沒有生物活性，需要caspase-1進行蛋白水解，導致IL-1β活性細胞因子的分泌。IL-1β是參與炎癥反應的重要細胞因子，不僅自身參與急慢性炎癥反應，更能誘發(fā)其下游多種炎癥介質的釋放，從而在動脈硬化發(fā)生發(fā)展的炎癥反應過程中發(fā)揮重要作用[17-18]。最近Canakinumab抗炎性血栓形成結果研究（CANTOS）[19]結果顯示，針對IL-1β通路的抗炎治療顯著降低了心血管事件的復發(fā)率，此外以IL-1β抑制為例的進一步研究強調了抗炎藥物潛在的治療價值[20]。人體動脈粥樣硬化斑塊，尤其是斑塊巨噬細胞中高表達IL-18，并且IL-18 水平升高與動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性相關[21]，IL-18 缺陷能使ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化有所改善[22]。本實驗結果顯示，AS模型小鼠胸主動脈caspase-1、IL-1β、IL-18 蛋白表達水平顯著升高，穿心蓮酸高、中劑量組均可有效地降低caspase-1、IL-1β、IL-18蛋白表達。以上結果表明穿心蓮酸可能通過NLRP3炎癥小體相關通路，降低AS 模型主動脈NLRP3、caspase-1、IL-1β及IL-18的表達水平，減輕炎癥對AS的影響。

綜上所述，本研究表明穿心蓮酸可以調節(jié)ApoE-/-小鼠AS 模型的血脂水平，改善主動脈病變及脂質沉積，下調主動脈NLRP3、caspase-1、IL-1β及IL-18 表達，減輕炎癥反應，發(fā)揮明顯抗AS 作用，調控NLRP3炎癥小體可能是穿心蓮酸發(fā)揮抗AS作用機制之一。