吳敬峰 ，趙亞丹 ，朱文明 ，及超，李聰杰

（1.保定市第二醫(yī)院骨二科，河北保定 071000；2.河北大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，河北保定 071000）

骨質(zhì)疏松癥是因機(jī)體骨量降低、骨結(jié)構(gòu)被破壞所致骨脆性升高的一種全身性代謝性骨疾病，屬于一種退行性疾病[1]。女性絕經(jīng)所致骨質(zhì)疏松癥是臨床骨質(zhì)疏松癥常見類型之一，由于絕經(jīng)后體內(nèi)雌性激素水平降低，導(dǎo)致骨生物力學(xué)性能降低，從而增加女性絕經(jīng)骨質(zhì)疏松癥風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)女性的主要公共衛(wèi)生存在威脅[2]。因此，預(yù)防絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥已成為骨科研究重點(diǎn)之一。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明，可能與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激過強(qiáng)以及相關(guān)蛋白表達(dá)異常有關(guān)。已有研究[3]表明，給予抗炎、抗氧化治療可有效緩解絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥臨床癥狀，目前臨床治療骨質(zhì)疏松癥常用藥物主要為鈣劑、維生素D、雌激素等，雖然表現(xiàn)出一定程度的治療效果，但是仍舊無法滿足骨質(zhì)疏松癥的臨床預(yù)防要求。因此，急需尋找新的預(yù)防骨質(zhì)疏松癥藥物。魚腥草是廣泛分布于中國、日本、韓國和泰國等亞洲國家的一種多年生草本植物，其中活性成分具有抗氧、抗炎和提高免疫力等作用[4]。魚腥草總黃酮為魚腥草成分之一，具有抑菌、抗過敏、延緩衰老和抗輻射等作用[5]。有研究[6]表明魚腥草揮發(fā)油可改善骨質(zhì)疏松癥癥狀，但是魚腥草總黃酮是否具有相似作用尚不明確。本研究旨在探討魚腥草總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠可能存在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雌性大鼠75只，4周齡，體質(zhì)量210～250 g，購于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCⅩK（冀）2018-004，購回后于適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，本研究均按照善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見進(jìn)行操作[7]。

1.2 主要試劑

魚腥草總黃酮（鄭州康吉元生物科技有限公司，1∶10）；破骨細(xì)胞相關(guān)受體（osteoclast-associated receptor，OSCAR）、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）抗體（美國Abcam 公司）；超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）、白介素-17（interleukin-17，IL-17）、白介素-23（interleukin-23，IL-23）和白介素-10（Interleukin-10，IL-10）試劑盒（武漢博士德生物技術(shù)有限公司）；HE 染色試劑盒、番紅染色試劑盒（美國Sigma公司）。

1.3 主要儀器

LCT200 Micro-CT 機(jī)（匯佳生物有限公司）；5910R 冷凍離心機(jī)（德國Eppendorf 公司）；HALO MPR-96 酶標(biāo)儀（瑞士Dynamica 公司）；ECHO revolve FL顯微鏡（美國ECHO公司）。

1.4 動(dòng)物分組及干預(yù)

將75 只雌性SD 大鼠均分為假手術(shù)組、模型組和魚腥草總黃酮低、中、高劑量組，除假手術(shù)組外其余各組大鼠均采用雙側(cè)卵巢切除術(shù)制備骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，詳細(xì)操作見文獻(xiàn)[8]，魚腥草總黃酮低、中、高劑量組術(shù)后分別灌胃0.5、1.0、2.0 g/kg 魚腥總黃酮[9]干預(yù)，假手術(shù)組和模型組大鼠灌胃等體積生理鹽水，連續(xù)干預(yù)4周。

1.5 骨指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥后24 h，使用Micro-CT 掃描檢測(cè)各組大鼠干預(yù)后骨體積分?jǐn)?shù)（bone volume/total volume，BV/TV）、特定骨表面積（trabecular bone surface/bone volume，BSA/BV）、骨小梁厚度（trabecular bone thickness，Tb.Th）、骨小梁分離度（trabecular bone space，Tb.Sp），掃描參數(shù)為90 kV、45 μA，曝光1 000 ms，掃描厚度12 μm，掃描角度360°。

1.6 HE染色和番紅染色

末次給藥后24 h，頸椎脫臼法處死大鼠，分離出脛骨，固定于4%（φ）多聚甲醛溶液中，經(jīng)脫鈣、脫水處理后，進(jìn)行石蠟包埋、切片，將所得片子用于HE染色、番紅染色，使用Image pro plus 系統(tǒng)分析骨小梁、軟骨占骨組織的百分比。

1.7 RT-PCR 檢測(cè)骨組織中OSCAR 和TRAP 基因表達(dá)

使用TRIzol法提取骨組織勻漿中總RNA，檢測(cè)RNA 的完整性和濃度，合成cDNA 第一條鏈，將其作為RT-PCR 擴(kuò)增模板，擴(kuò)增條件為95 ℃、30 s，95 ℃、15 s，60 ℃、34 s，總計(jì)40 個(gè)循環(huán)，采用2-△△Ct法計(jì)算OSCAR和TRAPmRNA相對(duì)水平。

1.8 Western blot檢測(cè)骨組織中OSCAR、TRAP 蛋白水平

提取骨組織勻漿總蛋白，考馬斯亮藍(lán)調(diào)整蛋白濃度至一致，然后依次經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜、5%脫脂奶粉密封2 h，然后加入兔多抗OSCAR、TRAP、ACTIN 一抗（1∶500），4 ℃孵育過夜，PBST 漂洗，加入HRP 標(biāo)記二抗（1∶500）孵育1 h，PBST 漂洗，加入ECL 顯色溶液，曝光，使用Image J軟件分析各組目標(biāo)條帶的相對(duì)灰度值。

1.9 骨組織SOD、MDA和GSH水平檢測(cè)

取骨組織勻漿，1 200 r/min 條件下離心10 min，取上清液備用，使用ELISA 法檢測(cè)上清液中SOD、MDA和GSH水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.10 外周血和骨組織中IL-17、IL-23 和IL-10 的含量檢測(cè)

骨組織勻漿上清液制備同“1.9”，取大鼠外周血2 mL，3 500 r/min 條件下離心15 min，取上清液備用，使用ELISA 法檢測(cè)骨組織勻漿和外周血上清液中IL-17、IL-23 和IL-10 水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 魚腥草總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨指標(biāo)的影響

如圖1 所示，與假手術(shù)組比較，模型組BV/TV、Tb.Th顯著降低（P＜0.05），BSA/BV、Tb.Sp顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，魚腥草總黃酮中、高劑量組BV/TV、Tb.Th 顯著升高（P＜0.05），BSA/BV、Tb.Sp顯著降低（P＜0.05）；魚腥草總黃酮低劑量組的BV/TV、Tb.Th、BSA/BV、Tb.Sp 與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 魚腥草總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨指標(biāo)的影響Figure 1 Effects of total flavonoids from Houttuynia cordata Thuub.on bone indexes in rats with osteoporosis

2.2 魚腥草總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠軟骨組織的影響

HE 染色（圖2）結(jié)果顯示，假手術(shù)組和魚腥草總黃酮低劑量組大鼠軟骨面較為光滑、細(xì)胞排列整齊，模型組大鼠軟骨表面存在有細(xì)胞丟失，魚腥草總黃酮中、高劑量組大鼠軟骨損傷程度得到緩解。番紅染色（圖3）結(jié)果顯示，假手術(shù)組和魚腥草總黃酮低劑量組大鼠軟骨表面光滑、細(xì)胞分布均勻且染色均勻，模型組大鼠軟骨細(xì)胞排列紊亂、番紅著色差，魚腥草總黃酮中、高劑量組大鼠軟骨細(xì)胞排列紊亂、番紅不易著色情況得到改善。

圖2 各組大鼠軟骨組織HE染色（400×）Figure 2 Images of HE staining showed cartilage tissues of rats in each group（400×）

圖3 各組大鼠軟骨組織番紅染色（400×）Figure 3 Images of Safranin staining showed cartilage tissues of rats in each group(400×)

2.3 魚腥草總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨小梁和軟骨的影響

如圖4所示，與假手術(shù)組比較，模型組骨小梁和軟骨含量降低（P＜0.05）；與模型組比較，魚腥草總黃酮中、高劑量組骨小梁和軟骨含量升高（P＜0.05）。

圖4 魚腥草總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠骨小梁和軟骨的影響Figure 4 Effects of total flavonoids from H.cordata on trabecular bones and cartilages in rats with osteoporosis

2.4 魚腥草總黃酮對(duì)骨組織SOD、MDA 和GSH 水平的影響

與假手術(shù)組相比，模型組骨組織SOD 水平降低（P＜0.05），骨組織MDA、GSH 水平升高（P＜0.05）；與模型組相比，魚腥草總黃酮中、高劑量組骨組織SOD 水平升高（P＜0.05），骨組織MDA、GSH 水平降低（P＜0.05），見表1。

表1 各組骨組織SOD、MDA和GSH水平比較Table 1 Comparison of SOD,MDA and GSH levels in bone tissues among all groups(n=7)

2.5 魚腥草總黃酮對(duì)骨吸收功能相關(guān)基因OSCAR和TRAP表達(dá)的影響

如圖5所示，與假手術(shù)組比較，模型組OSCAR和TRAP基因及蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，魚腥草總黃酮中、高劑量組OSCAR和TRAP基因及蛋白水平降低（P＜0.05）。

圖5 魚腥草總黃酮對(duì)骨吸收功能相關(guān)基因OSCAR和TRAP表達(dá)的影響Figure 5 Effects of total flavonoids from H.cordata on the expressions of bone resorption function related genes OSCAR and TRAP

2.6 魚腥草總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠L-17、IL-23和IL-10水平的影響

如圖6所示，與假手術(shù)組比較，模型組骨組織和外周血IL-17、IL-23、IL-10 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，魚腥草總黃酮中、高劑量組骨組織和外周血IL-17、IL-23水平顯著降低（P＜0.05），骨組織和外周血IL-10含量顯著升高（P＜0.05）。

圖6 魚腥草總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠IL-17、IL-23和IL-10水平的影響Figure 6 Effects of total flavonoids from H.cordata on levels of IL-17，IL-23 and IL-10 in rats with osteoporosis

3 討論

骨質(zhì)疏松癥所致骨折與成骨細(xì)胞形成和破骨細(xì)胞吸收不平衡有密切關(guān)系[10]，其發(fā)生與雌激素缺乏、持續(xù)性鈣損失、飲食習(xí)慣、日?；顒?dòng)以及藥物使用等情況有關(guān)[11-12]。魚腥草可作為中藥和食用植物，具有清熱解毒、消腫、利尿等功效，可用于潰瘍、膿瘡、腹瀉、濕疹等疾病治療[13]。魚腥草總黃酮是魚腥草主要活性成分之一，有研究[14]表明魚腥草總黃酮可調(diào)節(jié)人乳腺癌細(xì)胞凋亡進(jìn)程，本研究結(jié)果顯示魚腥草總黃酮（1.0 g/kg）可以提高骨質(zhì)疏松癥大鼠BV/TV、Tb.Th，降低BSA/BV、Tb.Sp。BV/TV 水平高低可以反映骨小梁的多少，水平升高說明骨合成代謝高于骨分解代謝[15]，骨質(zhì)疏松癥患者Tb.Th 呈降低狀態(tài)[16]。Tb.Sp主要體現(xiàn)松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)，其異常升高可以反映骨質(zhì)存在疏松[17]。本研究結(jié)果說明魚腥草總黃酮可以改善骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨質(zhì)疏松癥狀。

骨小梁是影響骨強(qiáng)度的重要因素之一，發(fā)揮著承載負(fù)荷作用。軟骨是由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)組成的組織，具有維持關(guān)節(jié)穩(wěn)定性、增加抗壓能力和支撐作用[18]。本研究結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松癥大鼠存在軟骨表面細(xì)胞丟失和骨小梁、軟骨含量降低情況，而魚腥草總黃酮處理可以逆轉(zhuǎn)上述趨勢(shì)，說明魚腥草總黃酮（1.0 g/kg）可以提高骨質(zhì)疏松癥大鼠骨小梁和軟骨水平。成骨分化能力削弱或抑制是引起骨質(zhì)疏松癥的重要因素之一，直接原因是骨形成速度低于骨吸收速度。本研究結(jié)果顯示骨質(zhì)疏松癥大鼠骨組織中的OSCAR和TRAP基因、蛋白水平升高，OSCAR和TRAP均為骨吸收相關(guān)因子，OSCAR可在破骨細(xì)胞中表達(dá)升高并參與破骨細(xì)胞的生成過程，說明骨質(zhì)疏松癥大鼠骨吸收能力增強(qiáng)，而骨形成能力降低。通過魚腥草總黃酮1.0 g/kg處理可以調(diào)節(jié)骨吸收，從而保護(hù)骨組織，此結(jié)果與文獻(xiàn)[19]趨勢(shì)相似。

骨質(zhì)疏松癥發(fā)病還與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)骨質(zhì)疏松癥大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)情況較健康大鼠增強(qiáng)，而給予魚腥草總黃酮1.0 g/kg處理可以降低MDA、GSH、IL-17、IL-23 水平，升高SOD 和IL-10含量。SOD 是具有清除氧自由基的抗氧化酶，MDA 是具有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)氧化產(chǎn)物，GSH 參與體內(nèi)氧化還原反應(yīng)。IL-10 是由調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分泌的抗炎性細(xì)胞因子，對(duì)T 細(xì)胞及抗原細(xì)胞信號(hào)的傳遞具有抑制作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)炎性細(xì)胞因子合成和抗體分泌的抑制作用。IL-17、IL-23 是由Th1 細(xì)胞分泌的促炎因子，IL-17 可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞炎癥趨化因子的生長和表達(dá)，加重炎癥反應(yīng)[20]。有研究[21]表明魚腥草具有抗氧化作用，本研究結(jié)果也呈現(xiàn)出相似趨勢(shì)，說明適宜濃度魚腥草總黃酮處理可以減低骨質(zhì)疏松癥大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)骨組織的保護(hù)作用。

綜上所述，魚腥草總黃酮可以改善骨質(zhì)疏松癥大鼠骨量減少情況，改善軟骨損傷嚴(yán)重程度，還可降低骨質(zhì)疏松大鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，改善骨質(zhì)疏松癥大鼠的成/破骨細(xì)胞間的功能平衡。本研究初步顯示魚腥草總黃酮對(duì)骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨損傷有預(yù)防作用，其具體的作用機(jī)制及可能涉及的信號(hào)通路還需要進(jìn)一步研究。