靳彩玲，姬穎華，王犖楠，楊軍，張清琴，牛紅蕊

（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤科，河南新鄉(xiāng) 453000）

肺癌是所有癌癥中發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，是嚴(yán)重的世界公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。目前，肺癌的具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，抑制肺癌細(xì)胞惡性生長(zhǎng)是肺癌治療的主要研究方向。天竺葵素（pelargonidin，PEL）是天然的花青素單體，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等生理活性[2]。大量研究報(bào)道，不同來(lái)源的PEL 對(duì)肺癌、胃癌、肝癌等均有一定的抑制作用[3-5]。但PEL 在肺癌中的具體作用機(jī)制尚不完全清楚。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析PEL在肺癌中的潛在治療靶點(diǎn)，并通過(guò)相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，旨在探討PEL 治療肺癌的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源 人肺癌細(xì)胞NCIH1975、NCI-H292 購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)；16 只BALB/c裸鼠，SPF級(jí)，雄性，6周齡，體質(zhì)量16～20 g，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCⅩK（豫）2017-0001。

1.1.2 藥品 PEL 購(gòu)自美國(guó)Sigma，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，取3.07 mg PEL 溶于10 mL 無(wú)菌水中，配制為100 mmol/L 母液，再梯度稀釋為10、20、25、40、50、80、100μmol/L的溶液。

1.1.3 試劑與儀器 干擾KIF11（shKIF11）慢病毒載體及雜序的短發(fā)卡RNA 陰性對(duì)照（shNC）、pcDNAKIF11 質(zhì)粒及其陰性對(duì)照物（Vector）由北京閱微基因技術(shù)股份有限公司提供；脂質(zhì)體2000 試劑盒（美國(guó)Invitrogen）；細(xì)胞計(jì)數(shù)（CCK-8）試劑（美國(guó)GLPBIO）；Transwell 小室、基質(zhì)膠（美國(guó)BD）；正常山羊血清、生物素化山羊抗兔、細(xì)胞裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）；兔抗細(xì)胞增殖抗原Ki67、KIF11 抗體（美國(guó)Abcam）；iMARK 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bi-Rad）；CⅩ21BIM-SET5顯微鏡（日本OLYMPUS）。

1.2 PEL潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和篩選

在PubChem 中獲取PEL 的SMILES 號(hào)，并導(dǎo)入SwissTarget 和TargetNet 數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取PEL 的預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)；下載TCGA_LUSC 數(shù)據(jù)矩陣，利用生信人工具采用t-檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行差異基因分析，篩選出在肺癌患者中表達(dá)上調(diào)的基因；下載TCGA_LUSC 臨床信息，將肺癌患者分為臨床分期I期和Ⅱ～Ⅳ期兩組以及T1期和T2～T4期兩組，進(jìn)行差異基因分析，篩選出在臨床分期Ⅱ～Ⅳ期/T2～T4期組中表達(dá)上調(diào)的基因。對(duì)PEL 潛在靶點(diǎn)、表達(dá)上調(diào)基因以及在臨床分期Ⅱ～Ⅳ期/T2～T4 期組中高表達(dá)的基因取交集。進(jìn)一步分析共同基因表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（N 分期）之間的關(guān)系，篩選出目標(biāo)基因KIF11。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

（1）添加不同濃度PEL處理細(xì)胞（NCI-H1975：10、25、50、100 μmol/L，NCI-H292：10、20、40、80 μmol/L），并設(shè)置空白對(duì)照（Control，不含藥物的培養(yǎng)基），觀察PEL 對(duì)NCI-H1975、NCI-H292 細(xì)胞活性及KIF11表達(dá)的影響；（2）選取細(xì)胞生存率約50%的PEL 濃度（NCI-H1975：50 μmol/L、NCI-H292：40 μmol/L）為實(shí)驗(yàn)濃度處理細(xì)胞，并設(shè)置空白對(duì)照（Control），觀察PEL對(duì)NCI-H1975、NCI-H292 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響；（3）構(gòu)建肺癌裸鼠荷瘤模型，分為Control組和PEL 組，觀察PEL 對(duì)裸鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響；（4）參照脂質(zhì)體2000 試劑盒操作，以shKIF11 慢病毒載體及shNC 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分為shNC 組、shKIF11 1#組和shKIF11 2#組，觀察KIF11低表達(dá)對(duì)NCI-H1975、NCI-H292 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響；（5）以pcDNA-KIF11 質(zhì)粒及Vector 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分為Vector 組和KIF11 組，檢測(cè)KIF11 蛋白的表達(dá)；（6）將細(xì)胞分為Contorl 組、PEL 組 和PEL+KIF11 組，觀 察PEL、KIF11 對(duì)NCI-H1975、NCI-H292 細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性

取各組細(xì)胞以1×105密度接種于96 孔板，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d，隔天更換新鮮培養(yǎng)基，添加含有10%（φ）CCK-8試劑的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于450 nm處檢測(cè)各孔吸光度（A）值，以吸光度值表示細(xì)胞活性。

1.5 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移

取各組細(xì)胞以1×106密度接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后，用200 μL 微量槍頭垂直于孔底劃痕，拍照記錄0 h 劃痕寬度，培養(yǎng)24 h，再次拍照記錄24 h 劃痕寬度。

1.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲

預(yù)先用基質(zhì)膠包被小室上室，取各組細(xì)胞以2×105密度接種于小室上室，下室添加含有10%（φ）胎牛血清培養(yǎng)基作為趨化物，培養(yǎng)48 h，取出小室輕輕拭去基質(zhì)膠和上室內(nèi)細(xì)胞，固定于冰甲醛溶液，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)侵襲細(xì)胞。

1.7 肺癌裸鼠荷瘤模型的建立

正常培養(yǎng)NCI-H1975 細(xì)胞，制備為5×106/L 細(xì)胞懸液，取0.2 mL 接種于裸鼠右腋部背側(cè)皮下，接種5～10 d 后觀察到接種部位可觸及腫瘤結(jié)節(jié)表明建模成功。將荷瘤模型裸鼠分為兩組：Control組和PEL 組，每組8 只，PEL 組隔天腹腔注射3 mg/kg PEL[6]，Control 組以等體積生理鹽水替代，測(cè)量腫瘤長(zhǎng)、短徑，計(jì)算其體積，藥物注射第14 天時(shí)處死裸鼠，剝?nèi)∧[瘤組織，測(cè)量體積及質(zhì)量后置于中性甲醛溶液中固定，制備石蠟切片。

1.8 免疫組化檢測(cè)腫瘤組織中增殖抗原標(biāo)記物Ki67的表達(dá)

取出腫瘤組織石蠟切片，經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后，滴加3%（φ）H2O2溶液滅活10 min，高溫修復(fù)抗原15 min，分別添加正常山羊血清、Ki67 一抗（稀釋比1∶100）、生物素化山羊抗兔（稀釋比1∶500），終止反應(yīng)后進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明后封片，顯微鏡下觀察陽(yáng)性染色細(xì)胞（棕黃色顆粒），利用Image-ProPlus 軟件測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞平均吸光度值（A）。

1.9 蛋白印跡檢測(cè)細(xì)胞中KIF11表達(dá)

添加細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞中總蛋白，測(cè)定濃度后，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，待蛋白完全分離后停止電泳，冰上轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入一抗KIF11（稀釋比1∶1 000），4 ℃下孵育過(guò)夜，再加入二抗（稀釋比1∶5 000），37 ℃孵育1 h，最后化學(xué)發(fā)光顯影。以β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）為內(nèi)參，計(jì)算KIF11的相對(duì)表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PEL潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和篩選

如圖1，韋恩分析結(jié)果顯示，SwissTarget 數(shù)據(jù)庫(kù)與TargetNet數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)PEL 的靶點(diǎn)，二者取并集得112 個(gè)靶點(diǎn)；下載TCGA_LUSC 數(shù)據(jù)矩陣和臨床信息，對(duì)PEL 潛在靶點(diǎn)、表達(dá)上調(diào)基因以及在臨床分期Ⅱ～Ⅳ期/T2～T4 期組中高表達(dá)的基因取交集，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有KIF11和周期素依賴性激酶1（CDK1）2 個(gè)共同基因。進(jìn)一步分析KIF11和CDK1基因表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系，結(jié)果表明N1 期組肺癌患者中KIF11表達(dá)水平更高（P＜0.05）。因此，KIF11作為目標(biāo)基因進(jìn)一步研究。

圖1 PEL潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和篩選Figure 1 Prediction and screening of PEL's potential targets

2.2 PEL對(duì)肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

如圖2，與Control組比較，10、25、50、100 μmol/L PEL 處理后NCI-H1975 細(xì)胞活性明顯降低，10、20、40、80 μmol/L PEL 處理后NCI-H292 細(xì)胞活性明顯降低（P＜0.05），50 μmol/L/40 μmol/L PEL 處理NCIH1975/NCI-H292 細(xì)胞后，細(xì)胞的存活率均在50%左右，因此選取50 μmol/L 和40 μmol/L PEL 干預(yù)NCI-H1975、NCI-H292 細(xì)胞做后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)。與Control 組比較，PEL 組細(xì)胞活性、遷移能力及侵襲數(shù)明顯降低（P＜0.05）。

圖2 PEL對(duì)肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響Figure 2 Effects of PEL on malignant biological behaviors of lung cancer cells

2.3 PEL對(duì)肺癌裸鼠荷瘤模型腫瘤生長(zhǎng)的影響

如圖3，與Control組比較，PEL組裸鼠腫瘤組織體積、質(zhì)量及Ki67陽(yáng)性表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。

圖3 PEL對(duì)肺癌裸鼠荷瘤模型腫瘤生長(zhǎng)的影響Figure 3 Effects of PEL on the growth of lung cancer in tumor-bearing nude mice models

2.4 PEL對(duì)肺癌細(xì)胞中KIF11表達(dá)的影響

如圖4，與Control 組比較，10、25、50、100 μmol/L PEL 處理后NCI-H1975 細(xì)胞中KIF11表達(dá)明顯降低，10、20、40、80 μmol/L PEL處理后NCI-H292細(xì)胞中KIF11表達(dá)明顯降低（P＜0.05），呈劑量依賴性。50 μmol/L和40 μmol/L PEL分別處理NCI-H1975和NCI-H292 細(xì)胞12、24、48 h，NCI-H1975、NCI-H292細(xì)胞中KIF11表達(dá)明顯降低（P＜0.05），呈時(shí)間依賴性。

圖4 PEL對(duì)肺癌細(xì)胞中KIF11表達(dá)的影響Figure 4 Effects of PEL on the expression of KIF11 in lung cancer cells

2.5 低表達(dá)KIF11 對(duì)肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

如圖5，與shNC組比較，shKIF11 1#組和shKIF11 2#組KIF11表達(dá)、細(xì)胞活性、遷移能力及侵襲數(shù)明顯降低（P＜0.05）。

圖5 低表達(dá)KIF11對(duì)肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響Figure 5 Effects of low-expression KIF11 on malignant biological behaviors of lung cancer cells

2.6 PEL 靶向KIF11 對(duì)肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響

如圖6，與Vector 組比較，KIF11 組KIF11表達(dá)明顯升高（P＜0.05）；與PEL 組比較，PEL+KIF11 組KIF11表達(dá)、細(xì)胞活性、遷移能力及侵襲數(shù)明顯升高（P＜0.05）。

圖6 PEL靶向KIF11對(duì)肺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的影響Figure 6 Effects of PEL on the malignant biological behaviors of lung cancer cells by targeting KIF11

3 討論

近年來(lái)，植物天然產(chǎn)物在阻止、逆轉(zhuǎn)或延緩癌癥進(jìn)展方面有重要作用，已成為腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[7]。研究表明，食用富含類黃酮的食物可能降低癌癥風(fēng)險(xiǎn)[8]。黃酮類化合物是植物中常見(jiàn)的一類次生代謝產(chǎn)物，可存在于植物葉子、花、種子、莖等多個(gè)部位，具有豐富的生物活性，如抗癌、抗氧化、抗病毒等[9-10]。PEL 是一種類黃酮前體化合物合成的花青素，也表現(xiàn)出一定的抗癌活性[11]。Chen 等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PEL 對(duì)骨肉瘤細(xì)胞U2OS 有明顯的抑制作用，可能與阻滯PI3K/AKT 信號(hào)通路有關(guān)。本研究通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞惡性生物學(xué)行為能力，發(fā)現(xiàn)PEL 可抑制肺癌細(xì)胞NCI-H1975、NCI-H292 的增殖、遷移及侵襲能力，同時(shí)構(gòu)建肺癌裸鼠荷瘤模型，通過(guò)腫瘤生長(zhǎng)曲線、體積、質(zhì)量及腫瘤組織中增殖抗原標(biāo)記物Ki67的表達(dá)，結(jié)果顯示PEL在體內(nèi)也表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤活性。但PEL 抗肺癌的具體分子機(jī)制尚不清楚。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析PEL 的潛在靶點(diǎn)，初步篩選出112 個(gè)靶點(diǎn)，進(jìn)一步下載TCGA_LUSC數(shù)據(jù)矩陣和臨床信息，最終確定KIF11為靶基因進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。驅(qū)動(dòng)蛋白超家族（KIFs）是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的一類蛋白，不僅可控制細(xì)胞形態(tài)，還在高級(jí)生物功能中有重要作用[13]。近期報(bào)道結(jié)果顯示，KIFs 還參與人類癌癥的發(fā)生發(fā)展[14]。KIF11作為成員之一，主要參與紡錘體的形成及其動(dòng)力學(xué)的維持，在多種癌癥中存在異常表達(dá)[15]。Zhou 等[16]利用生物信息學(xué)軟件篩查乳腺癌中差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)KIF11可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展的潛在致癌基因，與其不良預(yù)后密切相關(guān)。Yang 等[17]研究發(fā)現(xiàn)，KIF11、KIF4A、FOXM1等基因在卵巢癌中異常表達(dá)，與疾病進(jìn)展有關(guān)，可用于治療卵巢癌潛在靶向藥物的開(kāi)發(fā)。李蓉等[18]研究顯示，非小細(xì)胞肺癌中KIF11高表達(dá)，對(duì)于患者臨床診治和預(yù)后預(yù)測(cè)有較好前景。本研究結(jié)果顯示，KIF11在肺癌組織中異常高表達(dá)，且與患者臨床分期、T 分期及N 分期等臨床病理特征有關(guān)，提示KIF11高表達(dá)可能參與肺癌的發(fā)生發(fā)展。敲低KIF11表達(dá)后，肺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力明顯降低，證實(shí)KIF11在肺癌中發(fā)揮促癌因子作用。Hu[19]、Li[20]等基礎(chǔ)研究結(jié)果也顯示，KIF11可促進(jìn)肝癌、肺腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲。另外，PEL 處理細(xì)胞后，KIF11表達(dá)明顯降低，增強(qiáng)細(xì)胞中KIF11表達(dá)后，可逆轉(zhuǎn)PEL 對(duì)肺癌細(xì)胞的抑制作用，表明PEL 抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲，是通過(guò)靶向抑制KIF11表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，PEL可抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力，其作用機(jī)制可能與靶向抑制KIF11表達(dá)有關(guān)。但PEL 在肺癌中是否還存在其他作用途徑，仍需要深入分析和研究。