雷玉婷 ，楊艷紅，雷自立

[1.廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院，廣東廣州 510006；2.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院（臨床醫(yī)學(xué)院），廣東廣州510080]

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一種病因不明的慢性胃腸道炎癥性疾病，主要分為克羅恩?。╥nflammatory bowel disease，CD）和潰瘍性結(jié)腸炎（inflammatory bowel disease，UC）2類(lèi)[1]。近年來(lái)，隨著現(xiàn)代人的飲食和生活習(xí)慣的改變，IBD的發(fā)病率和患病率迅速增加，由IBD 引起的醫(yī)療費(fèi)用也給社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展帶來(lái)了巨大負(fù)擔(dān)[1-3]。用于治療IBD 的傳統(tǒng)藥物包括磺胺嘧啶、5-氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑等[1]?？鼓[瘤壞死因子（TNF）單克隆抗體和抗整合素，以及新開(kāi)發(fā)的白介素（IL）-12 和IL-23 的抗p40 亞基也已被批準(zhǔn)用于治療IBD[4-6]。這些藥物可以控制炎癥并促進(jìn)腸黏膜的愈合，但具有一些副作用，例如肝腎毒性，并且仍無(wú)法長(zhǎng)期緩解[1，6]。天然化合物具有多種生物和醫(yī)學(xué)活性，其有效性、高安全性、低毒性和可利用性吸引了越來(lái)越多的關(guān)注[7]。

青蒿素（artemisinin，分子式為C15H22O5）是一種倍半萜內(nèi)酯分子，含過(guò)氧基團(tuán)，有研究表明青蒿素及其衍生物在治療IBD 及結(jié)腸癌等方面有積極作用[8-9]。本實(shí)驗(yàn)室前期工作研究表明，雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）可明顯減輕葡聚糖硫酸鈉鹽（dextran sulfate sodium salt，DSS）誘導(dǎo)的IBD小鼠模型腹瀉和便血情況，顯著降低IBD 小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-23 水平，下調(diào)TNF-α、IL1β和IL-6在小鼠腸道的表達(dá)水平。此外，DHA 可改善IBD 小鼠腸道炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，上調(diào)小鼠結(jié)腸EpCAM、Claudin-1、Claudin-2、Claudin-3、Claudin-4、Claudin-7的表達(dá)水平，通過(guò)修復(fù)腸道緊密連接以及調(diào)控腸道菌群改善IBD[10]。

傳統(tǒng)中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，研究其治病機(jī)制比較困難[11]。IBD 患者呈現(xiàn)出多種多樣的病理特征，有各種先天性和適應(yīng)性免疫效應(yīng)子參與，這種異質(zhì)性導(dǎo)致各種動(dòng)物模型上的研究還是有缺陷的[12]。因此，應(yīng)用人類(lèi)生物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行研究很有必要。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)，通過(guò)生物網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)，查找相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)、利用多種信息化分析工具和方法來(lái)構(gòu)建各種生物、基因之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，借此系統(tǒng)地闡述“基因-靶點(diǎn)-疾病-藥物”之間復(fù)雜關(guān)系的一門(mén)新興網(wǎng)絡(luò)交叉學(xué)科[13]。本研究使用該方法，預(yù)測(cè)青蒿素對(duì)IBD 治療的活性成分、潛在作用靶點(diǎn)及作用機(jī)制，旨在為青蒿素在IBD 的潛在臨床應(yīng)用和深入研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 葡聚糖硫酸鈉（大連美侖生物技術(shù)有限公司）；羧甲基纖維素鈉（天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；雙氫青蒿素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；Trizol（Invitrogen 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara 公司）；引物（上海生工生物工程股份有限公司）；PikoReal 96型Real-time PCR儀（美國(guó)Thermo Fisher公司）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7周齡雌性SPF級(jí)C57BL/6小鼠購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體質(zhì)量20～23 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)43004700064578，在廣東藥科大學(xué)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，室溫25 ℃，12 h/12 h晝夜間斷光照。

1.2 方法

1.2.1 青蒿素靶點(diǎn)收集 以“artemisinin（青蒿素）”為關(guān)鍵詞在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)數(shù)據(jù)庫(kù)（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集數(shù)據(jù)，并按一定條件篩選青蒿成分，同時(shí)搜索Pubchem等其他數(shù)據(jù)庫(kù)作為補(bǔ)充，將獲得的Canonical SMILES 導(dǎo) 入Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.Drugbank.ca/）、PharmMapper（http：//lilab.ecust.edu.cn/phanmmapper/index.php），獲得青蒿素靶點(diǎn)[13]。

1.2.2 IBD 的靶點(diǎn)信息收集 通過(guò)查找TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//db.idrblab.net/ttd/）、Dru-gbank數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.Drugbank.ca/）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）中與IBD相關(guān)的靶點(diǎn)基因，將收集到的有關(guān)靶點(diǎn)基因信息全部導(dǎo)入U(xiǎn)niprot 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.Uniprot.org/），并對(duì)多個(gè)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)收集到的結(jié)果進(jìn)行整合[14]。

1.2.3 青蒿素與IBD 共同靶點(diǎn)收集 將收集到的青蒿素靶點(diǎn)和IBD 靶點(diǎn)制作成韋恩圖，兩圖交集區(qū)域即為共同靶點(diǎn)，是青蒿素對(duì)IBD的作用靶點(diǎn)。

1.2.4 構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò) 運(yùn)用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)將篩選出的直接作用靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白相互作用，獲得蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)出相關(guān)文件并分析，篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.2.5 生物學(xué)功能和通路分析 將青蒿素與IBD 共同靶點(diǎn)導(dǎo)入ClueGO 和DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.Ncifcrf.gov/），物種選擇人類(lèi)（Homo sapiens，Human），進(jìn)行GO（Gene Ontology）分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）分析。利用ImageGP 工具（http：//www.ehbio.com/ImageGP/）繪制青蒿素和IBD 共同靶點(diǎn)的前20 條生物學(xué)過(guò)程分析氣泡圖、細(xì)胞組分氣泡圖、分子功能氣泡圖以及KEGG通路氣泡圖[15]。

1.2.6 炎癥性腸病小鼠模型的建立 將7 周齡的C57BL/6 雄性小鼠放置于SPF 級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室喂養(yǎng)，并隨機(jī)分為3 組：對(duì)照組、DSS 組和DHA 組。其中DSS 組和DHA 組小鼠自由飲用4%（質(zhì)量濃度，下同）的DSS 水，對(duì)照組自由引用純凈水。第7 天時(shí)，DSS 組和DHA 組小鼠停止飲用4%的DSS 水，改為飲用與對(duì)照組一樣的純凈水。第12天時(shí)，DSS 組和DHA 組繼續(xù)自由飲用2%濃度的DSS 水，對(duì)照組繼續(xù)自由飲用純凈水，同時(shí)對(duì)照組和DSS組用0.5%羧甲基纖維素鈉每日灌胃1 次，DHA 組則用混懸于羧甲基纖維素鈉的0.5%雙氫青蒿素每日灌胃1 次，劑量為150 mg/kg。第18 天麻醉處死小鼠，取出結(jié)腸等組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.7 組織RNA 提取和Real-time PCR 使用TRIzol?reagent 試劑盒提取小鼠結(jié)腸組織的總RNA，并使用PrimeScriptTM RT Reagent kit 試劑盒去除基因組DNA 和逆轉(zhuǎn)錄。E-cardherin 引物序列為：E-cardherin-F，GGTCTCTTGTCCCTTCCACA；E-cardherin-R，CCTGACCCACACCAAAGTCT。使用PikoReal PCR 系統(tǒng)進(jìn)行Real-time PCR，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃5 s，60 ℃20 s，65 ℃15 s，40個(gè)循環(huán)，GAPDH作為內(nèi)參基因。

1.2.8 16S rDNA 基因分析及數(shù)據(jù)處理 糞便細(xì)菌DNA提取和16S rDNA基因測(cè)序分析由廣州基迪奧生物科技有限公司完成。從樣本中提取基因組DNA 后，用特異引物擴(kuò)增16S rDNA 的V3+V4 區(qū)，引物序列為：341F，CCTACGGGNGGCWGCAG；806R，GGACTACHVGGGTATCTAAT。將純化回收后的擴(kuò)增產(chǎn)物連接測(cè)序接頭，構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)，上機(jī)測(cè)序。利用quantitative insights into microbial ecology（QIIME，version1.9.1）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將得到的Raw reads 進(jìn)行過(guò)濾，得到Clean Tag，接下來(lái)對(duì)Clean Tag 進(jìn)行聚類(lèi)，得到的數(shù)據(jù)為Effective Tag。將這些基因序列用Uparse（version 9.2.64_i86linux32）進(jìn)行比對(duì)，得到OUT（operational taxonomic units），隨后使用Ribosomal database project classifier（version 2.2）對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行物種組成分析。使用Ace 和chao的方法計(jì)算細(xì)菌的豐度，使用Shannon和Simpson的方法計(jì)算細(xì)菌的多樣性，使用KEGG 對(duì)菌群進(jìn)行功能富集分析。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用軟件IBM SPSS Statistics 24.0 和graphpad Prism 7 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，3 組樣本采用單因素ANOVA 方法，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 青蒿素靶點(diǎn)的篩選

在Pubchem 數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得青蒿素的Canonical SMILES：CC1CCC2C（C（=O）OC3C24C1CCC（O3）（OO4）C）C，用得到的Canonical SMILES 在Swiss Target Prediction、Drugbank 數(shù)據(jù)庫(kù)、Pharm Mapper等多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索獲得青蒿素相關(guān)靶點(diǎn)，其中Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)252個(gè)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)3個(gè)、Pharm Mapper數(shù)據(jù)庫(kù)100個(gè)，導(dǎo)入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化、去掉重復(fù)值，最終得到341個(gè)青蒿素靶點(diǎn)。其中包括細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome oxidase，CYP1A2）、脂肪酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH）、Toll 樣受體9（toll-like receptor 9，TLR9）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、非受體型蛋白酪氨酸磷酸酶1（recombinant protein tyrosine phosphatase，PTPN1）、毒蕈堿型膽堿受體（M1 recombinant cholinergic receptor，Muscarinic 1，CHRM1）等。

2.2 IBD靶點(diǎn)信息收集和篩選

以“inflammation bowel disease”為關(guān)鍵詞，選擇homo spanies 作為物種，在疾病相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索IBD 的靶點(diǎn)基因，其中TTD 數(shù)據(jù)庫(kù)57 個(gè)、isGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)1 577個(gè)、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)11個(gè)，將靶點(diǎn)基因?qū)險(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因標(biāo)準(zhǔn)化后歸納整理，合并去掉重復(fù)基因，共得到1 629 個(gè)疾病基因，包括腫瘤壞死因子（TNF）、白介素10（IL-10）、白介素23（IL-23）、HPS1 溶酶體細(xì)胞器復(fù)合物3（HPS1 biogenesis of lysosomal organelles complex 3 subunit 1）、白介素6（IL-6）、Toll 樣受體9（toll-like receptor 9，TLR9）、細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM1）、趨化因子2（chemokine 2，CCL2）等。

2.3 青蒿素治療IBD的靶點(diǎn)收集

將青蒿素靶點(diǎn)和IBD 靶點(diǎn)取交集繪制成韋恩圖（見(jiàn)圖1），得到青蒿素和IBD的共同靶點(diǎn)有84個(gè)。將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建共同靶點(diǎn)間相互作用關(guān)系，其中置信度得分排名前20的蛋白相互作用見(jiàn)表1，以JAK2、AKT、ⅩIAP、MAPK、EFGR及STAT1 等蛋白相互作用置信度得分較高，這些基因主要集中在幾條重要的信號(hào)通路上，涉及腸道炎癥反應(yīng)、細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖和分化、細(xì)胞之間信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活等方面，說(shuō)明了這些靶點(diǎn)在青蒿素治療IBD過(guò)程中起主導(dǎo)作用。

表1 置信度得分排名前20的青蒿素和IBD共同靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系Table 1 Common target protein interaction between artemisinin and IBD with top 20 confidence score

圖1 青蒿素IBD交集靶點(diǎn)Venn圖Figure 1 Venn diagram of artemisinin and IBD

2.4 生物學(xué)功能和通路分析

2.4.1 GO 分析 將青蒿素和IBD 的84 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入ClueGO 分析，物種選擇Homo sapiens（Human），獲得富集網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果，其中GO-terms 為94個(gè)，GO-terms關(guān)系115條，總體統(tǒng)計(jì)之后做餅狀圖分析，見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)大部分GO-terms富集在調(diào)節(jié)分泌、平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子的產(chǎn)生與免疫反應(yīng)等過(guò)程中。將青蒿素和IBD 的84 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇Homo sapiens（Human），GO 分析共獲得288 條富集結(jié)果，其中189 個(gè)生物學(xué)過(guò)程分析、31個(gè)細(xì)胞組分、68個(gè)分子功能，主要涉及到細(xì)胞連接、信號(hào)傳導(dǎo)、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、先天免疫反應(yīng)、MAPK 級(jí)聯(lián)、嗜酸性粒細(xì)胞趨化性、革蘭陰性菌的防御反應(yīng)、寄主共生體生長(zhǎng)的負(fù)調(diào)控、單核巨噬細(xì)胞趨化性、氧氣輸送及免疫應(yīng)答等方面。

圖2 青蒿素與IBD靶點(diǎn)的富集網(wǎng)絡(luò)餅狀圖Figure 2 Pie chart of enrichment network of the targets of artemisinin and IBD

2.4.2 KEGG 分析 將青蒿素和IBD 的84 個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇Homo sapiens（Human），得到72 條KEGG 通路，其中有多條通路與青蒿素治療IBD 緊密相關(guān)，其中包括一些與細(xì)胞黏附連接有關(guān)的信號(hào)通路，如黏著斑（focal adhesion）信號(hào)通路和黏附連接（adherens junction）信號(hào)通路等，還包括大量與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的信號(hào)通路，如趨化因子信號(hào)通路（chemokine signaling pathway）、T細(xì)胞受體信號(hào)通路（T cell receptor signaling pathway）和NOD 樣受體信號(hào)通路（NOD-like receptor signaling pathway）、癌癥通路（proteoglycans in cancer、pathways in cancer）、Rap1 信號(hào)通路（rap1 signaling pathway）、結(jié)腸癌（colorectal cancer）、幽門(mén)螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)（epithelial cell signaling in helicobacter pylori infection）、TNF 信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）等，見(jiàn)表2。利用imageGP 工具繪制青蒿素IBD 信號(hào)通路氣泡圖，見(jiàn)圖3。最后將共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape中繪制“藥物-疾病-靶點(diǎn)-通路圖”，見(jiàn)圖4。

圖3 青蒿素治療IBD的KEGG通路氣泡圖Figure 3 Bubble diagram of KEGG pathway in IBD of artemisinin treatment

圖4 青蒿素與IBD的藥物—疾病—靶點(diǎn)—通路網(wǎng)絡(luò)互作圖Figure 4 Interaction network of drug-disease-target-pathway of artemisinin and IBD

表2 青蒿素和IBD的共同靶點(diǎn)富集的重要KECG信號(hào)通路Table 2 Important KECG signaling pathways enriched by common targets of artemisinin and IBD

2.5 相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證及分析

以上部分相關(guān)信號(hào)通路已經(jīng)在本課題組前期的研究中得到了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持[9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，DSS 誘導(dǎo)的炎癥性腸病小鼠腸道組織中黏附連接因子E-cardherin 表達(dá)水平顯著降低，用青蒿素衍生物雙氫青蒿素（DHA）處理后，結(jié)腸上黏附連接因子E-cardherin有恢復(fù)上調(diào)的趨勢(shì)，見(jiàn)圖5。腸道菌群測(cè)序結(jié)果顯示Bacteroidales_S24-7_group 在所有菌群豐度中占很大的比重，同時(shí)在門(mén)水平上，與對(duì)照組小鼠相比，DSS 組的Bacteroidales_S24-7_group豐度顯著降低，而給予DHA處理后，豐度明顯升高，見(jiàn)圖6。圖7 為3 組小鼠腸道菌群功能豐度熱圖。

圖5 E-cardherin在炎癥性腸病小鼠結(jié)腸組織中的表達(dá)水平Figure 5 Expression of E-cardherin in the colon of mice with inflammatory bowel disease

圖6 腸道菌群豐度分析Figure 6 Analysis of intestinal flora abundance

圖7 炎癥性腸病小鼠腸道菌群功能豐度熱圖Figure 7 Thermogram of functional abundance of the gut microbiota of the IBD mice

3 討論

本次研究中共收集獲得IBD 靶點(diǎn)1 629 個(gè)，青蒿素有效成分靶點(diǎn)341 個(gè)。其中，包含了84 個(gè)共同靶點(diǎn)，在這之中相互作用置信度得分比較高的靶點(diǎn)包括非受體型酪氨酸蛋白激酶家族（Janus kinase family，JAK family）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、AKT 絲氨酸/蘇氨酸激酶1（AKT Serine/Threonine Kinase 1，AKT1）和絲裂原激活的蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）等。對(duì)青蒿素治療IBD 的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析后，結(jié)果提示青蒿素可以通過(guò)調(diào)控多種生物學(xué)過(guò)程和分子功能來(lái)干涉和改善腸道炎癥，主要集中在positive regulation of secretion（分泌的正向調(diào)節(jié)）、regulation of smooth muscle cell proliferation（平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)）、cytokine production involved in immune response（免疫反應(yīng)中的細(xì)胞因子產(chǎn)生）等GO過(guò)程。這些GO過(guò)程提示了青蒿素不僅能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞因子的產(chǎn)生、改善腸道炎癥，還可能從正向調(diào)節(jié)分泌和增殖腸道平滑肌2個(gè)方向修復(fù)腸道屏障。在本課題組前期的研究中確實(shí)發(fā)現(xiàn)了雙氫青蒿素對(duì)腸道炎癥的改善作用和對(duì)腸上皮連接細(xì)胞緊密連接蛋白的上調(diào)作用[10]，但目前還沒(méi)有實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可以完全闡述其中的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步的探索。同時(shí)KEGG 分析結(jié)果可看出青蒿素在抗菌和預(yù)防結(jié)腸癌癥相關(guān)通路上也起到積極作用，如一些基因富集在Colorectal cancer（結(jié)腸癌）、Epithelial cell signaling inHelicobacter pyloriinfection（幽門(mén)螺桿菌感染中的上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)）等相關(guān)通路上。另外因炎癥因子生成和清除之間出現(xiàn)失衡而引發(fā)的機(jī)體損傷的積累效應(yīng)可顯著影響到肝臟、脾臟、骨骼肌等組織器官，這些常見(jiàn)的生物過(guò)程均在本研究中得到了富集，初步證實(shí)了青蒿素可通過(guò)調(diào)節(jié)多種分子、代謝過(guò)程分子功能來(lái)促進(jìn)機(jī)體改善IBD癥狀并預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生。

本研究對(duì)P≤0.01 的信號(hào)通路進(jìn)行篩選，獲得多條主要信號(hào)通路，其中與青蒿素治療IBD 緊密相關(guān)的通路主要集中在focal adhesion（黏著斑連接）和adherens junction（黏著連接）、chemokine signaling pathway（趨化因子信號(hào)通路）、T cell receptor signaling pathway（T 細(xì)胞信號(hào)通路）和NOD-like receptor signaling pathway（NOD 樣受體信號(hào)通路）等。腸上皮屏障功能受損一直都被認(rèn)為是炎癥性腸?。↖BD）的病理機(jī)制之一，腸屏障可以保護(hù)腸細(xì)胞免受病原微生物的侵害，腸屏障的損傷會(huì)改變腸道微生物群的組成、腸道的免疫系統(tǒng)和代謝，進(jìn)而導(dǎo)致炎癥性腸病甚至腸道癌癥的發(fā)生。腸上皮屏障由各種細(xì)胞連接組成，其中黏著斑連接和黏附連接也是這些細(xì)胞連接的重要組成部分，它們對(duì)腸上皮細(xì)胞之間的連接起著關(guān)鍵作用。從本文的分析結(jié)果來(lái)看，青蒿素治療IBD 的靶點(diǎn)在這2個(gè)重要的細(xì)胞連接通路上的富集也證明了青蒿素在修復(fù)細(xì)胞連接上有很好的效果，前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也證明了DHA在對(duì)炎癥性腸病小鼠的腸道上皮緊密連接方面有很顯著的修復(fù)作用[9]，但目前對(duì)于青蒿素修復(fù)上皮細(xì)胞連接的研究還很少，其具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步探索。

本研究中得到的一些重要的信號(hào)通路已經(jīng)在本課題組前期研究中得到了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，例如DSS誘導(dǎo)的炎癥性腸病小鼠腸道組織中黏附連接因子E-cardherin 表達(dá)水平顯著降低，用DHA 處理后E-cardherin 有恢復(fù)上調(diào)的趨勢(shì)，另外前期工作表明還有一些緊密連接因子，例如EpCAM、Claudin-2、Claudin-3、Claudin-7 的表達(dá)也得到了明顯的恢復(fù)[10]。同時(shí)，炎癥性腸病小鼠腸道菌群中擬桿菌科Bacteroidales_S24-7_group 的豐度顯著降低，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，擬桿菌科Bacteroidales_S24-7_group的豐度與發(fā)生炎癥的程度成反比[15]。在門(mén)水平上，與對(duì)照組小鼠相比，DSS 組的Bacteroidales_S24-7_group豐度顯著降低，而給予DHA 處理后，Bacteroidales_S24-7_group 豐度明顯升高。也就是說(shuō)，DHA 能顯著改善IBD 小鼠的菌群失調(diào)，增加有益菌的豐度，發(fā)揮治療作用。這些菌群的功能分析顯示DHA組菌群在cell motility 通路上顯著富集，可見(jiàn)DHA在恢復(fù)腸上皮細(xì)胞連接的同時(shí)激活了細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，這與用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)的DHA影響?zhàn)ぶ咝盘?hào)通路的預(yù)測(cè)一致。黏著斑信號(hào)在細(xì)胞運(yùn)動(dòng)上起著很重要的作用，一般在炎癥潰瘍傷口愈合期間，細(xì)胞的黏著斑信號(hào)及黏附連接極大地影響了細(xì)胞的遷移活動(dòng)，促進(jìn)了傷口的愈合[16]，菌群功能分析可看出DHA 對(duì)細(xì)胞連接的改善也體現(xiàn)在了細(xì)胞的遷移能力上。

通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析，本研究發(fā)現(xiàn)青蒿素不僅在多個(gè)靶點(diǎn)和多種信號(hào)通路發(fā)揮抗炎的作用，并且能夠恢復(fù)腸上皮細(xì)胞連接蛋白的水平，作用于多個(gè)通路靶點(diǎn)修復(fù)腸道屏障，這些特點(diǎn)都預(yù)示著青蒿素在治療炎癥性腸病的過(guò)程中可能會(huì)有意想不到的療效。因此，利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析平臺(tái)預(yù)測(cè)青蒿素靶點(diǎn)及IBD靶點(diǎn)對(duì)青蒿素治療IBD機(jī)制的研究具有重要意義，為今后的實(shí)驗(yàn)研究指明方向，并對(duì)青蒿素治療IBD的研究具有指導(dǎo)意義。