夏耀宗 ，施紹瑞 ，胡偉 ，劉翔，付杰

（1.宜賓市第二人民醫(yī)院檢驗科，四川宜賓 644000；2.第三軍醫(yī)大學附屬新橋醫(yī)院檢驗科，重慶 400037）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）是一種革蘭陰性致病菌，可引起尿路感染、肺炎等多種感染，其中克雷伯菌引發(fā)的肺炎在免疫功能低下的患者中尤為嚴重，死亡率在25%～60%之間[1]。在細菌性肺炎模型中，病原體到達下呼吸道，繁殖引起肺泡毛細血管充血、水腫、肺泡纖維蛋白滲出、細胞浸潤等炎性癥狀，產生大量炎癥因子，加重機體炎癥反應。β-欖香烯是從中藥莪術根莖中提取的一種非細胞毒性的抗腫瘤藥物，該化合物具有消炎和抗腫瘤特性，能夠通過血腦屏障。目前已報道β-欖香烯在體外和體內具有多種生物活性，如抗腫瘤[2]、多重耐藥性[3]和免疫調節(jié)[4-5]作用，但其抗炎作用仍不清楚。因此，本研究擬通過克雷伯菌復制大鼠急性肺炎模型，探索β-欖香烯對克雷伯菌致急性肺炎大鼠外周血中肺組織炎癥因子及纖維化指標的影響，及ERK1/2 和AKT 信號通路的參與情況，以期為急性肺炎臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

45 只5～8 月 齡SPF 級健康成年雄性Sprague Dawleg（SD）大鼠，體質量180～260 g，購自四川大學實驗動物中心，動物生產許可證號：SCⅩK（川）2018-026，動物使用的倫理審批號：LLPZ-016。

1.2 主要儀器

5430R高速離心機（德國Eppendorf公司）；Varioskan LUⅩ多功能酶標儀（美國賽默飛公司）；Eclipse 80i顯微鏡（日本尼康公司）；AMA440N 高壓滅菌鍋（英國Astell 公司）；ABI StepOnePlus TM 熒光定量PCR儀（美國基因儀器公司）。

1.3 藥品與試劑

β-欖香烯（江蘇菲亞生物科技有限公司）；阿奇霉素（蘇州俞氏藥業(yè)有限公司）；兔抗大鼠TGF-β1一抗（BioVision CA 94043 USA）；山羊抗兔二抗（Proteintech）；Tris-base（Roche）；十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecyl sulfate，SDS，武漢尚寶生物科技）；蛋白Marker（Fermentas）；乙二胺四乙酸（Ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA）緩沖液（pH 8.0，武漢百耐特化工有限公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit（北京寶日醫(yī)生物技術有限公司）；SYBR?Premix ExTaqTM（TliRNaseH Plus，日本Takara Bio 株式會社）；聚偏二氟乙烯膜（谷歌生物）；RIPA 強裂解液、ECL 發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；大鼠TNF-α、IL-10 ELISA 試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.4 菌液配制

氣管內接種前1天將肺炎克雷伯菌臨床株接種于血瓊脂平板上，置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。比濁法用無菌生理鹽水稀釋成含菌量2.4×108CFU/mL的混懸液備用。

1.5 肺炎克雷伯桿菌肺炎大鼠模型的建立

大鼠按50～100 mg/kg 經腹腔注射氯胺酮麻醉，頸部消毒、備皮后，無菌操作，暴露大鼠上段氣管，用1 mL注射器穿刺入氣管并滴入菌液。其中，模型組和各給藥組滴入0.15 mL濃度為2.4×108CFU/mL的菌液，正常組滴入相同劑量的生理鹽水。接種后立即豎立大鼠固定臺，使大鼠保持直立位約20 s，以保證接種菌液因重力作用而入肺。

1.6 分組與給藥

將大鼠隨機分為6 組：健康對照組、肺炎模型組、β-欖香烯低劑量組、β-欖香烯中劑量組、β-欖香烯高劑量組和阿奇霉素組，每組各9 只。阿奇霉素組（45 mg/kg），β-欖香烯低、中、高劑量組（20、40、80 mg/kg），灌胃給藥12 周。健康對照組給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉（carboxymethyl cellulose sodium，CMCNa）溶液。

1.7 方法

1.7.1 HE 染色 將各組大鼠肺組織置于4%（φ）多聚甲醛中固定72 h，隨后對已固定的肺組織置于20%（φ）乙二胺四乙酸中進行脫鈣處理，將樣品在梯度濃度的乙醇中脫水并包埋在石蠟中。將石蠟包埋的組織切成5 μm切片，于室溫下進行蘇木精染色10 min，隨后伊紅染色2 min。使用光學顯微鏡觀察肺組織病理學變化。

1.7.2 肺損傷評分和肺組織W/D 值檢測 收集肺組織用于檢測肺組織濕、干質量及肺組織病理分析。病理分析按“1.7.1”項行HE 染色后觀察進行病理結果評分。肺組織病理損傷評分標準：1 級（0 分），肺泡壁完好無增厚，無炎性浸潤，間質無水腫，無充血；2級（1分），肺泡內少量炎性細胞浸潤，肺泡壁未見增厚；3級（2分），明顯的炎性細胞浸潤，間質輕微水腫；4級（3分），明顯的炎性細胞浸潤，間質輕微水腫；5 級（4 分），嚴重的炎性細胞浸潤，間質中度水腫；6 級（5 分），嚴重的炎性細胞浸潤，間質重度水腫，纖維化物質沉積，組織局灶性壞死，肺泡壁結構不完整。參照肺炎癥程度的評判標準，在200 倍視野下，每張切片隨機選取5 個視野進行評分并計算總積分進行分析。肺濕、干質量的測定方法：剪下肺葉，用濾紙吸干，稱濕質量后置80 ℃干燥箱內烘干至恒重，計算肺組織濕/干比（W/D）。

1.7.3 RT-PCR檢測凋亡標記物Caspase-3,Caspase-9,Bax/Bcl-2,Survivin的基因表達 使用TRIzol 試劑提取總RNA，超微紫外光分光光度計測定吸光度（A260/A280）。按照Super RT cDNA 試劑盒說明書合成cDNA。通過Quantifast?SYBR?GreenPCR Kit 進行PCR 反應，反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，45 個循環(huán)。以GAPDH為內參，用2-△△Ct方法計算。用于該反應的引物信息見表1。

表1 RT-PCR的引物序列Table 1 Primer sequences of RT-PCR

1.7.4 ELISA 法測定外周血和肺組織中炎癥因子TNF-α和IL-10 的含量 取各組大鼠肺組織，滴入含有蛋白酶抑制劑的冰緩沖液，制作成勻漿液，離心收集上清液。按照ELISA 試劑盒說明書測定肺組織上清液TNF-α、IL-10 的含量，并用同樣的方法測定大鼠血清TNF-α、IL-10的含量。

1.7.5 Masson 染色 取出包埋處理的各組大鼠肺組織，進行組織切片，二甲苯脫蠟，高濃度到低濃度酒精脫水，Masson膠原染色試劑染色，二甲苯浸泡5 min，封片后在顯微鏡下觀察結果。

1.7.6 Western blot 法檢測Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Survivin、TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT 和p-AKT 蛋白表達量 各組大鼠肺組織勻漿加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，BCA 法測定蛋白含量。SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白轉移至PVDF 膜。4 ℃下加 入Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Survivin、TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN、ERK1/2、p-ERK1/2、AKT 和p-AKT 一抗（1∶1 000）孵育過夜，TBST 清洗后加入HRP-IgG（1∶10 000），加入電化學發(fā)光顯色液顯色。以β-actin 為內參，ImageJ V1.8.0.112 軟件分析各組細胞目的蛋白與Actin比值。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件對所有實驗數據進行統(tǒng)計分析，組間差異采用t檢驗或單因素方差分析進行檢驗。實驗結果以均數±標準差（）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 β-欖香烯對肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠肺組織病理的影響

肺組織形態(tài)變化見圖1。健康對照組肺臟層胸膜完整，結構正常，無水腫，無炎性細胞浸潤及充血。與健康對照組比較，模型組肺臟間質水腫嚴重，肺泡內出現大量炎性細胞浸潤和纖維素樣物質沉積，組織局灶性壞死，肺泡壁明顯增厚；與模型組比較，阿奇霉素組有少量炎性細胞浸潤，肺間質輕微水腫，肺泡壁結構完整；與模型組比較，低劑量組肺泡內含有大量炎性細胞浸潤，肺泡上皮細胞脫落，間質水腫嚴重，中劑量組肺泡內含大量炎性細胞，間質輕度水腫，個別區(qū)域肺泡壁增厚，高劑量組肺泡少量炎性細胞，間質輕度水腫。

圖1 各組大鼠肺組織病理學變化（HE染色，200×）Figure 1 Images of HE staining showed pathological morphological changes of the lung tissues in each group (HE staining,200×)

2.2 β-欖香烯對肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠肺損傷評分和W/D值的影響

如表2 所示，阿奇霉素組大鼠病理評分低于模型組（P＜0.05）。此外，與模型組比較，中、高劑量組大鼠病理評分均較低（P＜0.05）。與模型組比較，阿奇霉素組肺組織W/D 顯著降低（P＜0.05）；低劑量組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，中劑量組和高劑量組肺組織W/D 均顯著降低（P＜0.05）。結果表明β-欖香烯能減輕肺損傷，降低肺水腫。

表2 各組大鼠肺組織損傷評分和W/D值Table 2 Lung tissue injury scores and W/D values in each group

2.3 β-欖香烯對肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠肺組織凋亡的影響

如圖2所示，與健康對照組比較，模型組肺組織Bax/Bcl-2、caspase-9、caspase-3mRNA 和蛋白表達顯著增高，SurvivinmRNA和蛋白表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，阿奇霉素組肺組織Bax/Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9mRNA和蛋白表達顯著降低（P＜0.05），而肺組織SurvivinmRNA和蛋白表達卻顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組肺組織各基因的表達無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），中劑量組和高劑量組肺組織Bax/Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9mRNA和蛋白表達均顯著降低（P＜0.05），而SurvivinmRNA和蛋白表達卻顯著升高（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肺組織凋亡標記物基因的表達Figure 2 Expression of apoptosis marker genes in each group

2.4 β-欖香烯對肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠炎癥因子的影響

如圖3所示，與健康對照組比較，模型組血清和肺組織中TNF-α、IL-10的含量差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，阿奇霉素組血清和肺組織中TNF-α含量顯著升高（P＜0.05），IL-10含量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，中、高劑量組血清和肺組織中TNF-α含量顯著降低（P＜0.05），IL-10含量顯著升高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠血清和肺組織中TNF-α和IL-10的含量Figure 3 The level of TNF-α and IL-10 in serum and lung tissues in each group

2.5 β-欖香烯對肺炎克雷伯菌急性肺炎大鼠肺纖維化的影響

各組大鼠進行Masson 染色，如圖4 所示，健康對照組未觀察到明顯膠原沉積，肺泡間隔正常，結構未見破壞。模型組可見膠原沉積增多，肺泡間隔增寬，結構異常缺失，許多正常肺泡結構為膠原纖維代替。低、中劑量組肺泡結構、肺泡間隔基本與模型組相似，膠原纖維較健康對照組增多，但較模型組略有減少；病變程度和范圍均較模型組輕。高劑量組和阿奇霉素組肺泡結構趨于完整、肺泡間隔正常，少見膠原沉積。

圖4 各組大鼠肺組織Masson染色病理學檢查結果（Masson染色，200×）Figure 4 Images of Masson staining showed pathological results of lung tissue in each group(Masson,200×)

如圖5 所示，從Western blot 結果中可以看出，阿奇霉素組、β-欖香烯中、高劑量組中TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN 蛋白表達量較模型組降低。與健康對照組比較，模型組中TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿奇霉素組、β-欖香烯中、高劑量組中TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。

圖5 各組大鼠肺纖維化標記物蛋白表達Figure 5 Protein expression of pulmonary fibrosis markers in each group

2.5 β-欖香烯對ERK1/2和AKT磷酸化的影響

Western blot 檢測各組大鼠p-ERK1/2 和p-AKT水平，如圖6 所示，與健康對照組比較，模型組大鼠高表達p-ERK1/2 和p-AKT 蛋白。與模型組比較，β-欖香烯低劑量組p-ERK1/2 和p-AKT 蛋白表達無明顯差異，β-欖香烯中、高劑量組和阿奇霉素組p-ERK1/2和p-AKT蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。

圖6 各組大鼠ERK1/2和AKT的磷酸化情況Figure 6 Phosphorylation levels of ERK1/2 and AKT in each group

3 討論

肺炎是敗血癥最常見的病因，肺炎克雷伯菌是肺炎和敗血癥的常見病原體[6-7]?？股赝ǔＳ糜诜窝卓死撞腥镜闹委?，其中碳青霉烯類藥物被認為是廣泛用作肺炎克雷伯菌引起的嚴重感染的首選藥物，尤其是產生β-內酰胺酶的菌株[8]。然而，由于克雷伯菌具有多重耐藥機制，目前治療方法的療效不斷下降，一些肺炎克雷伯菌對抗生素具有高度耐藥性[9]。因此，探尋新的能夠治療肺炎克雷伯菌感染的高效、安全的藥物是臨床治療克雷伯菌急性肺炎的重要環(huán)節(jié)。

在細菌性肺炎模型中，肺組織產生大量炎癥因子，加重體內炎癥反應。研究表明，β-欖香烯在多種炎性疾病和癌癥中發(fā)揮調控作用，如β-欖香烯通過下調缺氧誘導因子（HIF-1α）、誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和血管內皮生長因子（VEGF）表達水平保護STZ 誘導的糖尿病大鼠肺損傷，β-欖香烯通過降低細胞增殖、代謝和侵襲能力抑制多種癌細胞的惡性生物學行為[10-12]。本研究發(fā)現β-欖香烯能明顯改善克雷伯菌急性肺炎大鼠肺組織病理損傷，降低肺組織的W/D 值，提示β-欖香烯可減輕肺炎克雷伯菌引起的肺損傷。

β-欖香烯可激活Caspase-3、7、9 和10，以及對Bcl-2 蛋白家族的影響引發(fā)凋亡性細胞死亡[13-14]。Zhang 等[15]報道稱，β-欖香烯可抑制Survivin表達以及Survivin與乙型肝炎病毒Ⅹ蛋白相互作用蛋白之間的相互作用，研究還發(fā)現β-欖香烯在體外促進神經膠質瘤細胞的凋亡。而本研究發(fā)現β-欖香烯抑制Caspase-3和Caspase-9表達，促進Bcl-2/Bax和Survivin的表達。這可能與β-欖香烯對不同疾病所起作用存在差異有關，其有待進一步研究。

肺炎克雷伯菌感染可引起炎癥細胞流入肺實質，并伴有促炎細胞因子和化學因子的釋放，造成中性粒細胞聚集[16-17]。Fang 等[18]發(fā)現在RAW264.7 巨噬細胞系中β-欖香烯能明顯抑制脂多糖誘導的促炎性介質，包括IL-6、TNF-α和IL-1β的產生。此外，β-欖香烯抑制脂多糖誘導的RAW264.7 巨噬細胞中iNOS 和IL-10 的表達，β-欖香烯的抗炎作用與其對Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路的調節(jié)密切相關[18]。本研究發(fā)現，β-欖香烯能抑制外周血和肺組織中的TNFα水平，提高IL-10 水平。TNF-α可以通過T 細胞促進各種炎癥細胞因子的產生，從而促進炎癥反應的發(fā)生?？寡仔约毎蜃覫L-10 抑制單核巨噬細胞釋放炎癥介質，增強抗炎性因子釋放，抑制炎癥反應的發(fā)生。本研究結果表明β-欖香烯針對克雷伯菌急性肺炎具有潛在的抗炎作用。

在肺纖維化中，正常的肺組織結構被瘢痕組織所取代，瘢痕組織通常以膠原沉積和成纖維細胞增殖為特征。本研究采用Masson 染色發(fā)現β-欖香烯使成纖維細胞數量減少，肺間質區(qū)細胞外基質過度沉積得以緩解。TGF-β1 是主要的促纖維化細胞因子之一，在肺纖維化的發(fā)病機制中起著重要作用。而在肺纖維化過程中，成纖維細胞被激活并轉化為肌成纖維細胞，其中α-SMA 表達和細胞外基質ECM 蛋白沉積，被認為是肌成纖維細胞的標志物[19]。本研究發(fā)現β-欖香烯可顯著降低TGF-β1、α-SMA、Col-I、FN 蛋白表達水平，表明β-欖香烯可以減輕肺纖維化。

肺纖維化與細胞因子和激酶激活肺組織纖維化信號通路有關，其中ERK1/2 是細胞表面到細胞內部信號轉導的重要遞質。ERK1/2 是成纖維細胞增殖和分化信號傳導的共同途徑，也是成纖維細胞向核內多次信號轉導的共同途徑。ERK1/2/AKT 信號傳導通路在肺纖維化中細胞增殖、分化、新陳代謝及凋亡過程中有著重要作用，ERK1/2/AKT 蛋白過表達，促進肺間質纖維化生物學行為[20-21]。本研究發(fā)現β-欖香烯顯著降低ERK1/2 和AKT的磷酸化水平，表明β-欖香烯可能通過ERK1/2 和AKT 信號通路抑制肺成纖維細胞分化。

綜上所述，本研究通過克雷伯菌建立大鼠急性肺炎模型，觀察到β-欖香烯能抑制ERK1/2 和AKT的磷酸化，表明β-欖香烯對克雷伯菌急性肺炎具有抗炎作用，能降低炎癥因子水平，使肺纖維化程度得以減輕，為β-欖香烯應用于急性肺炎的臨床防治提供了理論依據。