劉 茜

(梧州學(xué)院 化學(xué)工程與資源再利用學(xué)院，廣西 梧州 543002)

自由基是生命活動(dòng)時(shí)所產(chǎn)生的一種帶有未成對(duì)電子的基團(tuán)，在生命體的新陳代謝過(guò)程中，自由基對(duì)機(jī)能的平衡調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要作用。但是，如果生命體內(nèi)有過(guò)多的自由基，也會(huì)對(duì)生命體造成傷害，它會(huì)使蛋白質(zhì)、核酸(DNA)變性等，也會(huì)加速生命體的衰老進(jìn)程和各種疾病的產(chǎn)生[1-5]。為此，研發(fā)高效無(wú)毒、天然的自由基清除劑更符合大眾對(duì)綠色安全保健品的意愿。蒲桃，為桃金娘科植物，又名水蒲桃、水石榴，香果等，學(xué)名為Syzygiumjambos(L.)Alston，熱帶亞熱帶多年生的常綠喬木[6]。蒲桃的花期為3、4月，觀賞價(jià)值高，蒲桃的地上部分，除莖之外的其他部位均可入藥?！侗静菰傩隆分杏涊d蒲桃“味甘酸﹐性熱,無(wú)毒;入脾﹑肺二經(jīng);暖胃健脾。治肺虛寒嗽，破血積疽瘤?！逼烟抑泻袑?duì)自由基具有良好清除活性的黃酮類(lèi)、多酚類(lèi)等，這為蒲桃開(kāi)發(fā)為天然無(wú)毒的抗氧化劑提供了物質(zhì)基礎(chǔ)[7-9]。為此，本試驗(yàn)采用乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、蒸餾水3種不同極性溶劑對(duì)蒲桃花進(jìn)行超聲提取，通過(guò)比較所得提取物對(duì)自由基的清除作用，分析不同極性溶劑對(duì)提取物清除自由基的影響，為深入研究蒲桃花活性成分的提取及其抗氧化活性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑、儀器及原料

1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，上海金穗生物科技有限公司)；2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，上海金穗生物科技有限公司)；其余試劑均為分析純。

SB-5200D超聲清洗機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)，752N紫外分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)，DF-101S型集熱式磁力加熱攪拌器(金壇市晶玻實(shí)驗(yàn)儀器廠)，低溫冷卻液循環(huán)泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海申生科技有限公司)。

蒲桃花，采集于梧州學(xué)院旦沖蒲桃果園。

1.2 蒲桃花提取物的制備

采摘新鮮蒲桃花，經(jīng)梧州學(xué)院植物學(xué)教師鑒定為桃金娘科屬的蒲桃〔Syzygiumjambos(L.)Alston〕花，60℃恒溫干燥8 h，粉碎。稱(chēng)取3份10.0 g粉碎后的蒲桃花分別加入乙酸乙酯、無(wú)水乙醇、蒸餾水各150 mL，常溫下超聲輔助提取1 h，提取液抽濾，濾液經(jīng)減壓濃縮至10 mL，濃縮液自然揮發(fā)剩余溶劑，分別得到提取物EAE、AAE和DWE。

1.3 蒲桃花提取物對(duì)DPPH·清除作用試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)，根據(jù)不同極性溶劑得到的提取物對(duì)DPPH·清除能力的不同，配制相應(yīng)的蒲桃花提取物的系列質(zhì)量濃度溶液，分別將各質(zhì)量濃度溶液與DPPH·溶液混合暗處避光反應(yīng)30 min，立刻測(cè)混合液在波長(zhǎng)為517 nm下的吸光度，重復(fù)試驗(yàn)3次[5,10-12]。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、自由基清除率為縱坐標(biāo)，擬合得 DPPH·清除率與不同極性溶劑提取物的濃度關(guān)系曲線(圖1)。根據(jù)曲線方程，算出不同極性溶劑所得提取物對(duì)DPPH·半抑制質(zhì)量濃度IC50值(表1)，并與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑BHT(2,6-二叔丁基對(duì)甲酚)的IC50值對(duì)比。

圖1 蒲桃花提取物對(duì)DPPH·的清除作用 圖2 蒲桃花提取物對(duì)ABTS+·的清除作用

1.4 蒲桃花提取物對(duì)ABTS+·清除作用試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)，制備ABTS+·儲(chǔ)備溶液，同時(shí)根據(jù)不同極性溶劑得到的提取物對(duì)ABTS+·清除能力的不同，配制相應(yīng)的蒲桃花提取物的系列質(zhì)量濃度溶液，取ABTS+·儲(chǔ)備液1.9 mL與各濃度浸膏溶液0.1 mL在室溫暗處混合3 min，然后立刻測(cè)混合液在波長(zhǎng)為734 nm下的吸光度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次[5,12]。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、自由基清除率為縱坐標(biāo)，擬合得ABTS+·自由基清除率與不同極性溶劑提取物的濃度關(guān)系曲線(圖2)，根據(jù)曲線方程，算出不同極性溶劑所得提取物對(duì)ABTS+·半抑制質(zhì)量濃度IC50值(表1)，并與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑BHT的IC50值對(duì)比。

1.5 蒲桃花提取物對(duì)·OH清除作用試驗(yàn)

參考文獻(xiàn)，根據(jù)不同極性溶劑得到的提取物對(duì)·OH清除能力的不同，配制相應(yīng)的蒲桃花提取物的系列質(zhì)量濃度溶液，測(cè)定各質(zhì)量濃度的蒲桃花提取物溶液與利用Fenton試劑產(chǎn)生的·OH作用后在波長(zhǎng)為510 nm下的吸光度，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次[5,13]，并根據(jù)Fenton法的計(jì)算公式計(jì)算其清除率，根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、自由基清除率為縱坐標(biāo)，擬合得·OH清除率與不同極性溶劑提取物的濃度關(guān)系曲線(圖3)，根據(jù)曲線方程，算出不同極性溶劑所得提取物對(duì)·OH半抑制質(zhì)量濃度IC50值(表1)，并與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑BHT的IC50值對(duì)比。

圖3 蒲桃花提取物對(duì)·OH的清除作用

2 結(jié)果與討論

為保證試驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確，對(duì)同一批次采集到的蒲桃花進(jìn)行提取物對(duì)自由基清除作用的測(cè)定時(shí)，每個(gè)濃度溶液平行測(cè)定3次，確保數(shù)值在相對(duì)誤差允許范圍內(nèi)，排除偶然誤差對(duì)本試驗(yàn)的干擾，最后取平均值，即為該濃度下水蒲桃花提取物對(duì)自由基的清除作用值。

衡量物質(zhì)抗氧化能力的重要指標(biāo)是對(duì)各類(lèi)自由基如DPPH·、ABTS+·和·OH的清除能力。試驗(yàn)中，常用物質(zhì)清除50%自由基的質(zhì)量濃度來(lái)衡量其清除自由基的活性。半抑制劑量IC50值越大，表明該物質(zhì)清除自由基的活性越低，而當(dāng)物質(zhì)的IC50<10 mg/mL時(shí)，表明其與自由基相互作用強(qiáng)，有良好的自由基清除活性[5，13]。同時(shí)，與標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑BHT的IC50對(duì)比也能說(shuō)明抗氧化劑的清除活性。

此外，探討溶劑效應(yīng)對(duì)提取物活性成分不同的影響，再進(jìn)一步探討活性成分不同而導(dǎo)致其與自由基的作用程度的不同，對(duì)于準(zhǔn)確評(píng)估蒲桃花提取物的抗氧化活性具有一定的試驗(yàn)意義，故我們?cè)谠囼?yàn)中用3種不同極性溶劑對(duì)蒲桃花活性成分進(jìn)行提取，并對(duì)比3種提取物對(duì)自由基作用情況。

2.1 蒲桃花提取物清除DPPH·的結(jié)果

DPPH·是一種藍(lán)紫色而相對(duì)較穩(wěn)定的自由基，隨著自由基清除試劑的加入，DPPH·最大吸收波長(zhǎng)的吸光度會(huì)相應(yīng)地降低。因此，可通過(guò)其與自由基清除試劑相互作用后的吸光度變化來(lái)評(píng)價(jià)清除試劑的抗氧化能力。從表1和圖1中可知不同提取試劑得到的蒲桃花提取物EAE、AAE和DWE對(duì)DPPH·的清除效果，隨提取物質(zhì)量濃度的增加清除率也在增大。與標(biāo)準(zhǔn)值10 mg/mL及標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑BHT的IC50值(14.50 mg/mL)[11]比較，3種不同極性溶劑得到的提取物對(duì)DPPH·的IC50值更小，分別為0.130，0.014，0.044 mg/mL，說(shuō)明3種不同極性溶劑得到的提取物對(duì)DPPH·均有良好的清除活性，特別是無(wú)水乙醇和蒸餾水為溶劑所得的提取物的清除效果相當(dāng)明顯，遠(yuǎn)大于乙酸乙酯為提取溶劑的清除效果。提取物的清除活性順序?yàn)锳AE > DWE>> EAE。對(duì)比這3種不同極性溶劑得到的提取物清除活性可知，以無(wú)水乙醇提取得到的提取物對(duì)DPPH·的清除能力最強(qiáng)，蒸餾水的次之，最差的是乙酸乙酯所得提取物。從溶劑極性來(lái)看，無(wú)水乙醇和蒸餾水的極性較大，乙酸乙酯極性較小，而AAE和DWE對(duì)DPPH·的清除能力明顯比EAE強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)說(shuō)明極性大的溶劑所得提取物對(duì)DPPH·的清除活性更大。

2.2 蒲桃花提取物清除ABTS+·的結(jié)果

測(cè)量物質(zhì)抗氧化活性的另一重要指標(biāo)是對(duì)ABTS+·自由基的清除活性。根據(jù)表1和圖2中數(shù)據(jù)分析：蒲桃花提取物EAE,AAE和DWE對(duì)ABTS+·也表現(xiàn)出良好的清除活性，隨提取物濃度的增加，清除率也在增加，各提取物的IC50值分別為0.210，0.016，0.066 mg/mL，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于標(biāo)準(zhǔn)的抗氧化劑BHT的IC50值81.43 mg/mL[11]和衡量物質(zhì)是否有清除活性的標(biāo)準(zhǔn)值10 mg/mL，各提取清除活性順序?yàn)锳AE > DWE >EAE。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)可得：提取溶劑極性對(duì)提取物的ABTS+·的清除活性的影響與清除DPPH·的相似，極性大的無(wú)水乙醇和蒸餾水所得的提取物清除ABTS+·的活性更大。

2.3 蒲桃花提取物清除·OH的結(jié)果

依據(jù)表1和圖3的數(shù)據(jù)，在對(duì)·OH的清除活性試驗(yàn)中，蒲桃花提取物對(duì)·OH同樣具有良好的清除活性，3種提取物對(duì)·OH的清除活性的IC50值分別為1.44，0.77，0.97 mg/mL，均低于標(biāo)準(zhǔn)值10 mg/mL。從試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，提取物對(duì)·OH的清除活性依然受提取溶劑極性的影響，隨著溶劑極性的變小，浸膏對(duì)·OH清除的IC50值也在增大，清除活性變小，其對(duì)·OH的清除活性順序?yàn)锳AE > DWE >EAE。

表1 蒲桃花提取物和BHT的IC50 mg/mL

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明不同極性溶劑提取所得的蒲桃花中的活性物性對(duì)3種自由基作用結(jié)果有著一定的差別。本試驗(yàn)中，對(duì)自由基表現(xiàn)出最好的清除活性是以無(wú)水乙醇為溶劑得到的蒲桃花提取物(AAE)，蒸餾水的(WAE)次之，乙酸乙酯為溶劑得到的桃花提取物(EAE)的自由基清除活性稍差。分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知：極性大的溶劑所得提取物清除3種自由基的活性相對(duì)大些，可初步推斷蒲桃花中的活性成分的極性稍大。這為今后蒲桃的綜合開(kāi)發(fā)和利用提供了一定的理論基礎(chǔ)。