邵志華，李 姣，許 潔，賈 松，沙繼宏，呂立夏，徐 磊，李思光

（同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院a.細(xì)胞生物學(xué)系；b.醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心；c.生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，上海 200092）

0 引言

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是一種多功能、高通量、高效的生物檢測(cè)技術(shù)，其在科研和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的作用越來(lái)越凸顯。根據(jù)細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞表面的標(biāo)志物不同，F(xiàn)CM能夠精確、快速地對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析和分選［1］。FCM被廣泛應(yīng)用于疾病診斷、細(xì)胞治療和藥物研發(fā)等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，已成為醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、診斷和科研的重要手段［2-4］。因此，在醫(yī)學(xué)院校開(kāi)展FCM的實(shí)驗(yàn)教學(xué)，對(duì)提高醫(yī)學(xué)生的前沿知識(shí)水平和實(shí)驗(yàn)技能具有重要意義。自2004 年北京大學(xué)首次開(kāi)展FCM的實(shí)驗(yàn)教學(xué)以來(lái)［5］，國(guó)內(nèi)外多所大學(xué)先后對(duì)本科生進(jìn)行了FCM實(shí)驗(yàn)教學(xué)的嘗試，取得了比較滿意的效果［6-9］。為了適應(yīng)科技發(fā)展的需要，提高學(xué)校的實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平，我校醫(yī)學(xué)院開(kāi)展了FCM的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。

組織干細(xì)胞是存在于胎兒和成人各種組織和器官中的一類細(xì)胞，具有自我更新和分化潛能，異質(zhì)性是組織干細(xì)胞的主要特征之一［10］。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是存在于骨髓中的異質(zhì)性細(xì)胞群，其中多能成體祖細(xì)胞（Multipotent adult progenitor cells，MAPCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）是骨髓基質(zhì)中兩種主要的非造血干細(xì)胞，它們均可在體外增殖和分化，在疾病的移植治療方面有著巨大的應(yīng)用潛力，如神經(jīng)退行性疾病的再生治療。對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和分化研究證實(shí)，二者在形態(tài)、表面標(biāo)志物和分化能力方面存在較大差異。MAPCs 的干性較強(qiáng)，可以分化為3個(gè)胚層的細(xì)胞，在年輕的骨髓中含量較高，主要為小三角形細(xì)胞，高表達(dá)CD90、OCT4、Nanog，低表達(dá)CD105、CD73、CD44、CD54 和HLA-ABC［11］；而MSCs的干性較局限，可以向中胚層和神經(jīng)外胚層分化，是大梭形細(xì)胞，高表達(dá)CD90、CD105、CD73、CD44、CD54、CD29 和HLA-ABC［12］。因此，準(zhǔn)確掌握干細(xì)胞的生物學(xué)特性對(duì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用具有重要意義。

自2015 年以來(lái)，我校一直為臨床醫(yī)學(xué)本科生開(kāi)展精品實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目——“大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與分化”［13］，細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果穩(wěn)定。但是，由于條件限制，未能進(jìn)行細(xì)胞鑒定和亞群分析。近年來(lái)，醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心購(gòu)置了一臺(tái)分析型流式細(xì)胞儀（FACSVerse，BD），這為開(kāi)設(shè)流式細(xì)胞術(shù)的教學(xué)提供了條件。采用大鼠骨髓來(lái)源的干細(xì)胞為材料，選用表面標(biāo)志蛋白CD105 和CD90 對(duì)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行亞群分析，目的是在進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)教學(xué)的同時(shí)，加深學(xué)生對(duì)干細(xì)胞特性的理解。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與方法

1.1 教學(xué)內(nèi)容和教學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容包括理論知識(shí)、實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析。理論知識(shí)包括流式細(xì)胞儀的工作原理和組成、熒光素的發(fā)光原理；操作技能包括流式樣本的處理、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、染色方法；數(shù)據(jù)分析包括流式軟件的使用、數(shù)據(jù)處理、流式圖的解釋和分析。

以2018 級(jí)臨床醫(yī)學(xué)專業(yè)二年級(jí)本科生（22 人）為研究對(duì)象。采用翻轉(zhuǎn)課堂教學(xué)法。第1 次課前，學(xué)生自主學(xué)習(xí)骨髓基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)的原理（微課視頻），熟悉實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程（JOVE 視頻和PDF 文檔），繪制實(shí)驗(yàn)流程圖，完成課前測(cè)試；教師收集學(xué)生的不明問(wèn)題。課中，在教師的引導(dǎo)下對(duì)不明問(wèn)題進(jìn)行討論，教師講解難點(diǎn)，梳理實(shí)驗(yàn)流程，最后學(xué)生分組實(shí)驗(yàn)操作。課后，學(xué)生分組進(jìn)行細(xì)胞換液和傳代，做好實(shí)驗(yàn)記錄。第2次課前，學(xué)生自主學(xué)習(xí)流式相關(guān)知識(shí)，包括原理、儀器的組成和應(yīng)用范圍等（univ流式課堂），學(xué)習(xí)FlowJo軟件的使用和流式結(jié)果分析（univ 流式課堂）、繪制實(shí)驗(yàn)流程圖。同樣，課中在教師的引導(dǎo)下對(duì)不明問(wèn)題進(jìn)行討論，教師講解難點(diǎn)，梳理實(shí)驗(yàn)流程，學(xué)生分組實(shí)驗(yàn)操作，最后老師演示上機(jī)，導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)，學(xué)生使用FlowJo軟件獨(dú)立分析數(shù)據(jù)，教師隨時(shí)解答學(xué)生的不明問(wèn)題。課后，學(xué)生撰寫(xiě)實(shí)驗(yàn)記錄并完成課后測(cè)試。最后以測(cè)試、實(shí)驗(yàn)流程圖和實(shí)驗(yàn)記錄的完成情況作為考核內(nèi)容進(jìn)行考核。

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

實(shí)驗(yàn)分2 次進(jìn)行。第1 次進(jìn)行骨髓基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)，第2 次進(jìn)行抗體標(biāo)記和流式分析。原代培養(yǎng)和抗體標(biāo)記由學(xué)生課內(nèi)分組（每組2 人）進(jìn)行操作，每組1 只3 周齡SD大鼠。換液和傳代由學(xué)生利用課外時(shí)間在教師的指導(dǎo)下分組完成。流式分析由教師演示，導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)后，學(xué)生根據(jù)視頻利用FlowJo 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)具體步驟如下：

（1）骨髓基質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)。解剖股骨，分離骨髓基質(zhì)細(xì)胞，接種于6 孔板中（3 個(gè)復(fù)孔），培養(yǎng)基為L(zhǎng)-DMEM +雙抗+10%FBS。2 天后更換培養(yǎng)液，棄掉未貼壁細(xì)胞。以后每3 天換液1 次，6～7 天傳代。

（2）抗體標(biāo)記。7 天后，骨髓基質(zhì)細(xì)胞約80%匯合，棄上清，PBS 清洗后，用0.05%胰酶消化分離細(xì)胞。分別將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到1.5 mL 離心管中。實(shí)驗(yàn)組加入CD105-488（1∶40）和CD90-APC（1∶300）；同型對(duì)照組加入Isotype Control-488（1 ∶40）和Isotype Control-APC（1∶300）；空白組加入抗體稀釋液。4 ℃避光孵育1 h。流式緩沖液清洗過(guò)濾后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入流式管中。

（3）數(shù)據(jù)采集。教師示范開(kāi)機(jī)、上樣、設(shè)門(mén)和導(dǎo)出數(shù)據(jù)。

（4）數(shù)據(jù)分析。根據(jù)視頻，每位學(xué)生自行安裝FlowJo軟件，并使用軟件獨(dú)立分析數(shù)據(jù)，包括數(shù)據(jù)導(dǎo)入、設(shè)門(mén)、分析結(jié)果，結(jié)果導(dǎo)出等。

1.3 教學(xué)評(píng)價(jià)

通過(guò)測(cè)試成績(jī)和自評(píng)問(wèn)卷進(jìn)行評(píng)價(jià)。測(cè)試內(nèi)容為流式相關(guān)知識(shí)，包括單選題和多選題。成績(jī)采用課前測(cè)試成績(jī)和課后測(cè)試成績(jī)。對(duì)流式細(xì)胞術(shù)的熟練程度進(jìn)行5 級(jí)評(píng)分。問(wèn)卷通過(guò)問(wèn)卷星發(fā)放，共收回有效問(wèn)卷22 份，回收率100.00%（22/22）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS26.0 進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性好

實(shí)驗(yàn)采用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，取材方便，容易操作，細(xì)胞增殖快，每組（100%）均可獲得穩(wěn)定的結(jié)果（見(jiàn)圖1、2）。原代培養(yǎng)可見(jiàn)小三角形和大梭形細(xì)胞。流式分析顯示，SD 大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞中MAPCs 細(xì)胞（CD90+/CD105-）的比例較高，為35.5%；MSCs 細(xì)胞（CD90+/CD105+）含量較少，為22.9%。

圖1 骨髓基質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)顯微照片

圖2 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞流式分析

2.2 促進(jìn)了學(xué)生對(duì)干細(xì)胞特性的理解

流式分析結(jié)果顯示，SD大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞并不是單一的細(xì)胞群，由CD90+/CD105-（35.5%）、（15.6%）三個(gè)亞群組成。100%的學(xué)生認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)促進(jìn)了他們對(duì)干細(xì)胞特性的理解，加深了學(xué)習(xí)的深度。

2.3 提高了學(xué)生的成績(jī)和流式技能

對(duì)流式相關(guān)知識(shí)的課前和課后測(cè)試結(jié)果顯示（見(jiàn)圖3），課后測(cè)試的平均成績(jī)［（81.76 ±11.85）分］明顯高于課前［（44.12 ±16.22）分］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。課后單選題［（45.88 ±5.07）分］和多選題［（35.88 ± 10.64）分］的平均成績(jī)均高于課前［（33.53 ±13.67）分和（10.59 ±8.99）分］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，多選題的分?jǐn)?shù)提高明顯。對(duì)流式技能的自評(píng)分析顯示（見(jiàn)表1），學(xué)生已基本熟練掌握流式工作原理（4.06 ±0.90）、操作流程（4.18±1.07）、對(duì)照設(shè)計(jì)（4.06 ±1.14）、軟件的使用（4.29±0.92）和結(jié)果解釋（4.12 ±1.05）。然而，對(duì)熒光染料的選擇（3.94 ±1.14）尚未達(dá)到熟練水平，提示需要加強(qiáng)此內(nèi)容的教學(xué)。

圖3 實(shí)驗(yàn)組課前和課后測(cè)試成績(jī)比較

表1 學(xué)生對(duì)學(xué)習(xí)效果自評(píng)（，分）

表1 學(xué)生對(duì)學(xué)習(xí)效果自評(píng)（，分）

3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)討論

目前，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有多所院校為不同層次的醫(yī)學(xué)生開(kāi)展了流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)。在以本科生為教學(xué)對(duì)象的實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，通常以微生物、細(xì)胞系和免疫細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料［6，9，14-16，］。如2019 年，White 等［9］以金黃色葡萄球菌為材料，開(kāi)展了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)菌膜電位的教學(xué)；2014 年，Ott 等［14］以HEK293 細(xì)胞系為材料，開(kāi)展了流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率的教學(xué)；2018 年，黃國(guó)虹等［16］進(jìn)行了T 淋巴細(xì)胞亞群的檢測(cè)的教學(xué)。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞是一類具有自我更新及分化潛能的細(xì)胞，因其巨大的實(shí)用價(jià)值，已經(jīng)成為世界醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。自2015年以來(lái)，本校已經(jīng)為二年級(jí)的本科生開(kāi)展了骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)［13］，實(shí)踐證明骨髓基質(zhì)干細(xì)胞取材方便、培養(yǎng)成功率高，適合低年級(jí)的本科生操作。結(jié)合研究熱點(diǎn)和自身的基礎(chǔ)，本實(shí)驗(yàn)采用骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為材料進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)的教學(xué)。結(jié)果證明，實(shí)驗(yàn)效果穩(wěn)定，100%的學(xué)生可獲得滿意的結(jié)果。學(xué)生認(rèn)為實(shí)驗(yàn)促進(jìn)了他們對(duì)干細(xì)胞特性的理解，加深了學(xué)習(xí)的深度。

在教學(xué)內(nèi)容上，國(guó)內(nèi)的流式細(xì)胞術(shù)教學(xué)主要以儀器的原理、實(shí)驗(yàn)操作和儀器演示為主；而國(guó)外的教學(xué)除了基本理論和實(shí)驗(yàn)操作外，還會(huì)安排軟件使用和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容。如2004 年，Boothby 等［17］讓學(xué)生在完成基本理論學(xué)習(xí)的基礎(chǔ)上，提出問(wèn)題、設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，然后分組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)、采集并分析數(shù)據(jù)。學(xué)生們認(rèn)為教學(xué)提高了他們的分析數(shù)據(jù)和對(duì)科研課題的理解能力。2016年，F(xiàn)uller等［18］在學(xué)生完成流式基本理論學(xué)習(xí)后，設(shè)計(jì)了FlowJo軟件的互動(dòng)教學(xué)，他們?yōu)閷W(xué)生提供原始的流式數(shù)據(jù)，要求每位學(xué)生獨(dú)立分析數(shù)據(jù)。他們的研究證明將復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析任務(wù)納入課堂，有益于學(xué)生理解和掌握復(fù)雜的概念，提高學(xué)生的自信。本實(shí)驗(yàn)在完成基礎(chǔ)理論學(xué)習(xí)和實(shí)驗(yàn)操作的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了FlowJo 流式軟件的實(shí)踐環(huán)節(jié)，包括軟件安裝、數(shù)據(jù)導(dǎo)入、設(shè)門(mén)、分析結(jié)果，結(jié)果導(dǎo)出等。學(xué)生反映，本實(shí)驗(yàn)提高了他們的流式實(shí)驗(yàn)技能。自評(píng)分析顯示學(xué)生已經(jīng)熟練掌握軟件的使用（4.29 ±0.92）和解釋結(jié)果（4.12 ±1.05）。然而，由于儀器數(shù)量的限制，數(shù)據(jù)采集僅進(jìn)行了示范教學(xué)，學(xué)生未能進(jìn)行上機(jī)操作。

在教學(xué)方法上，采用了翻轉(zhuǎn)課堂教學(xué)，課前學(xué)生自主學(xué)習(xí)并完成前測(cè)，課上在教師的幫助下解決難點(diǎn)和困難、完成實(shí)驗(yàn)操作，課后完成實(shí)驗(yàn)記錄和后測(cè)。多項(xiàng)研究顯示［19-21］，翻轉(zhuǎn)課堂能提高學(xué)生的積極性和滿意度、加深學(xué)習(xí)的廣度和深度。研究顯示，學(xué)生課后測(cè)試的平均成績(jī)［（81.76 ± 11.85）分］明顯高于課前［（44.12 ± 16.22）分］，其中多選題的平均成績(jī)［（35.88 ±10.64）分］顯著高于課前［（10.59 ±8.99）分］。自評(píng)結(jié)果顯示學(xué)生熟練掌握流式工作原理（4.06 ±0.90）、操作流程（4.18 ±1.07）、對(duì)照設(shè)計(jì)（4.06 ±1.14）。然而，學(xué)生對(duì)熒光染料選擇（3.94 ±1.14）自評(píng)分?jǐn)?shù)較低，這是因?yàn)闊晒饪贵w是由教師選擇并訂購(gòu)，未讓學(xué)生參與，導(dǎo)致學(xué)生對(duì)這個(gè)實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)掌握不足。

4 結(jié)語(yǔ)

在精品實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目——“大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)與分化”基礎(chǔ)上，將干細(xì)胞培養(yǎng)與流式細(xì)胞術(shù)相結(jié)合，建立了以骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為材料的流式分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)采用翻轉(zhuǎn)課堂教學(xué)法，注重理論知識(shí)、實(shí)驗(yàn)操作、軟件使用和數(shù)據(jù)分析多種能力的培養(yǎng)。自2018 年以來(lái)的教學(xué)實(shí)踐證明實(shí)驗(yàn)容易操作，效果穩(wěn)定，獲得了學(xué)生的認(rèn)可，適合為本科生開(kāi)展。以骨髓基質(zhì)干細(xì)胞為材料的流式分析實(shí)驗(yàn)提高了學(xué)生的前沿知識(shí)水平和實(shí)驗(yàn)技能，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目，提升了本校的實(shí)驗(yàn)教學(xué)水平。