溫 雪，張志華，張榮娟，郝長(zhǎng)來(lái)

(承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，河北 承德 067000)

遺傳性球形紅細(xì)胞增多癥(HS)是一種具有明顯異質(zhì)性的家族性溶血性疾病。HS作為一種常見(jiàn)的遺傳性溶血性疾病，是北歐和北美最常見(jiàn)的遺傳性慢性溶血的原因，據(jù)報(bào)道發(fā)病率為1/2000[1]，我國(guó)人群發(fā)病率約1/10萬(wàn)[2]。本病臨床癥狀多種多樣，從無(wú)癥狀貧血到溶血性危象，妊娠、突然失血或疊加感染均可加重。但因其癥狀不典型, 如沒(méi)有癥狀的攜帶者臨床沒(méi)有溶血征象，但紅細(xì)胞滲透脆性增加，有遺傳性球形紅細(xì)胞的基因突變，后代可以發(fā)生HS；或輕型的HS患者由于其骨髓代償功能好，可以沒(méi)有或僅有輕度貧血和脾腫大，血清膽紅素和網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)輕度增高，外周血球形紅細(xì)胞比較少見(jiàn)。故實(shí)驗(yàn)室檢查易受影響, 誤診、漏診率高[3]。本研究就1例臨床上表現(xiàn)為全血細(xì)胞減少的患者，應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)以及Sanger測(cè)序法確診為HS 2型患者進(jìn)行報(bào)告如下。

1 臨床資料

患者，女，29歲，主因發(fā)現(xiàn)貧血5年，發(fā)熱、乏力2天于2020年3月16日就診我院。既往5年前因“妊高癥”行剖宮產(chǎn)術(shù)，有輸血史。家族中其他成員無(wú)類(lèi)似病史。入院查體：患者神清語(yǔ)利，貧血貌。皮膚、黏膜蒼白，淺表淋巴結(jié)未觸及腫大，鞏膜無(wú)黃染，肝脾觸診不滿意，雙下肢無(wú)水腫。輔助檢查：血常規(guī)+網(wǎng)織細(xì)胞計(jì)數(shù)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)1.28×109/L，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)1.19×1012/L，血紅蛋白44 g/L，血小板計(jì)數(shù)48×109/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比13.8%，平均紅細(xì)胞體積(MCV)118.6 fL，平均血紅蛋白含量(MCH)39.7 pg，平均血紅蛋白濃度(MCHC)335 g/L，葉酸17.16 nmol/L，維生素B12 164.2 pmol/L, 血涂片檢查：中性分葉核粒細(xì)胞90%，淋巴細(xì)胞9%，單核細(xì)胞1%。溶血相關(guān)檢查：蔗糖溶血試驗(yàn)、血清酸化溶血試驗(yàn)(Ham)、直接抗人球蛋白試驗(yàn)(Coombs)、紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)、冷凝集試驗(yàn)，均未見(jiàn)異常，PNH免疫分型：紅細(xì)胞CD59缺失百分率0.83%；粒細(xì)胞中FLAER缺失細(xì)胞百分率0.00%。腹部CT：脾大。骨髓象(髂骨)：增生活躍(-)，原始細(xì)胞未見(jiàn)，紅系增生減低，巨核細(xì)胞不少。骨髓免疫分型：大致正常。骨髓病理活檢：HE及PAS染色示骨髓增生較低下(50%)，粒紅比例大致正常，粒系各階段細(xì)胞可見(jiàn)，以中幼及以下階段為主，紅系各階段細(xì)胞可見(jiàn)，以中晚幼紅細(xì)胞為主，巨核細(xì)胞數(shù)量大致正常；少量淋巴細(xì)胞散在分布。網(wǎng)狀纖維染色(MF-1級(jí))。診斷全血細(xì)胞減少癥，給予葉酸、腺苷鈷胺等藥物治療，監(jiān)測(cè)血常規(guī)+網(wǎng)織細(xì)胞計(jì)數(shù)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)5.26×109/L，血紅蛋白77 g/L，血小板計(jì)數(shù)94×109/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比14.0%，MCV 114.3 fL，MCH 37.8 pg，MCHC 331 g/L，葉酸34.28 nmol/L，維生素B12 484 pmol/L。肝功能：總膽紅素27.9 μmol/L，非結(jié)合膽紅素27.2 μmol/L，血清總膽汁酸15 μmol/L。復(fù)查骨髓象：增生明顯活躍，粒系比例減低，紅系明顯增生，可見(jiàn)花瓣核、畸形核幼紅細(xì)胞，成熟紅細(xì)胞大小不一。共見(jiàn)巨核細(xì)胞36個(gè)。髓系腫瘤二代測(cè)序：陰性，診斷為骨髓增生異常綜合征(MDS)？給予環(huán)孢素治療后，監(jiān)測(cè)血常規(guī)+網(wǎng)織細(xì)胞計(jì)數(shù)：白細(xì)胞計(jì)數(shù)4.97×109/L，紅細(xì)胞計(jì)數(shù)1.50×1012/L，血紅蛋白59 g/L，血小板計(jì)數(shù)74×109/L，網(wǎng)織紅細(xì)胞百分比16.1%， MCV 103.4 fL， MCH 33.3 pg， MCHC 322 g/L，肝功能：總膽紅素72.06 μmol/L，直接膽紅素19.20 μmol/L，因其治療過(guò)程中感染好轉(zhuǎn)，白細(xì)胞降低至正常值，血小板升高但仍低于正常值，貧血依舊，考慮為溶血性貧血，建議患者行相關(guān)基因檢測(cè)。見(jiàn)圖1。

圖1 患者骨髓形態(tài)學(xué)檢查 a.骨髓病理活檢； b.骨髓象分析

基因檢查：采集患者及其父親、母親外周血標(biāo)本4 ml(EDTA抗凝)，對(duì)患者進(jìn)行高通量測(cè)序，其父親、母親進(jìn)行Sanger驗(yàn)證。經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)患者SPTB基因有1個(gè)雜合突變： 在5551號(hào)核苷酸由胞嘧啶 C變?yōu)樾叵汆奏?T(c.5551C>T)的雜合突變，導(dǎo)致氨基酸發(fā)生無(wú)義突變(p.Q1851X)。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，c.5551C>T(p.Q1851X)受檢人之父該位點(diǎn)無(wú)變異，受檢人之母該位點(diǎn)無(wú)變異，故此變異為自發(fā)突變。美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)遺傳變異信息詳細(xì)解讀：c.5551C>T(exon26，NM_001355436)，導(dǎo)致氨基酸改變p.Q1851X，該變異為零效變異(無(wú)義突變)，可能導(dǎo)致基因功能喪失。根據(jù) ACMG指南，該變異初步判定為 致病性變異(pathogenic)，且在正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)中的頻率為(-)，為低頻變異；文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)未有該位點(diǎn)的相關(guān)性報(bào)道 ClinVar 數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)該位點(diǎn)致病性分析結(jié)果?；颊咄瑫r(shí)合并存在ANK1基因雜合突變c.1495G>T(p.A499S)，受檢人之父該位點(diǎn)雜合變異，受檢人之母該位點(diǎn)無(wú)變異，但其父親無(wú)相關(guān)臨床癥狀，根據(jù) ACMG指南，該變異初步判定為臨床意義未明，故此為非致病基因。見(jiàn)圖2～3。

圖2 患者及其父母SPTB基因測(cè)序 a.患者SPTB 基因雜合突變 c.5551C>T(p.Q1851X)；b、c.患者父親、母親 SPTB 基因型為野生型

2 突變基因的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析

使用SWISS-MODEL軟件(http://swissmodel.expasy.org)對(duì)SPTB基因突變進(jìn)行同源建模。使用模型為3kbu.1.A，序列同源性為99.07%，相似性為61%。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)c.5551C>T(p.Q1851X) 位點(diǎn)變異導(dǎo)致蛋白截?cái)嗤蛔儭＝財(cái)嗤蛔兪悄切┦沟鞍踪|(zhì)產(chǎn)物變短因而弱化或破壞蛋白質(zhì)功能的某些突變，這種截?cái)嗤蛔儼o(wú)義突變和移碼突變。研究發(fā)現(xiàn)移碼突變是膜結(jié)合域和膜收縮蛋白結(jié)合域中最常見(jiàn)的突變類(lèi)型，將導(dǎo)致成熟前翻譯終止信號(hào)的出現(xiàn)；而無(wú)義突變則是調(diào)節(jié)域中最常見(jiàn)的，可致使基因編碼的蛋白質(zhì)失去原有的功能[4]。見(jiàn)圖4。

圖3 患者及其父母ANK1基因測(cè)序 a.患者ANK1基因雜合突變c.1495G>T(p.A499S)；b.患者父親ANK1基因在該位點(diǎn)為雜合變異(無(wú)致病性)；c.患兒母親ANK1 基因型為野生型

圖4 SPTB基因突變前后的蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) a.野生型結(jié)構(gòu)； b.突變型結(jié)構(gòu)

3 討 論

HS是一種常見(jiàn)的遺傳性溶血性貧血，因外周血中出現(xiàn)球形紅細(xì)胞而得名。其特點(diǎn)為血液中包含大量球形紅細(xì)胞，臨床癥狀的嚴(yán)重程度、膜蛋白缺陷和遺傳模式存在廣泛的異質(zhì)性[5]。在所有HS患者中，約75%為常染色體顯性遺傳，15%為常染色體隱形遺傳，無(wú)家族史的散發(fā)病例可能為新發(fā)生的基因突變所致[6]。病理基礎(chǔ)為紅細(xì)胞膜蛋白基因異常，致膜骨架蛋白缺陷，細(xì)胞膜脂質(zhì)丟失，細(xì)胞表面積減少，細(xì)胞球形變，通過(guò)脾臟時(shí)容易被破壞。目前脾切除術(shù)是治療HS的唯一方法。

HS的發(fā)病機(jī)制為基因缺陷導(dǎo)致的紅細(xì)胞膜蛋白異常[7]，與HS紅細(xì)胞膜和脂質(zhì)雙分子層相互作用相關(guān)的基因有5個(gè)，包括:SPTA1、SPTB、ANK1、SLC4A1和EPB42，分別導(dǎo)致錨蛋白、β收縮蛋白、帶3蛋白、4.2蛋白和α收縮蛋白缺陷或異常[8]?！?個(gè)HS相關(guān)基因突變可導(dǎo)致膜蛋白缺失，進(jìn)而導(dǎo)致HS[9]。這5個(gè)基因的突變?cè)趪?guó)家間存在差異，歐美人群最常見(jiàn)的是ANK1 基因突變，約占 HS 半數(shù)。我國(guó)HS 患者常見(jiàn)的突變基因?yàn)锳NK1 和SPTB， 主要表現(xiàn)為錯(cuò)義突變和無(wú)義突變。HS 相關(guān)基因突變與嚴(yán)重程度之間無(wú)顯著相關(guān)性[10]，因此HS在臨床上容易被誤診和忽略。

HS典型的臨床表現(xiàn)有貧血、溶血性黃疸、脾大，感染可使病情加重，常伴膽石癥、痛風(fēng)、頑固的踝部潰爛或下肢紅斑性潰瘍等并發(fā)癥。典型的血常規(guī)為血紅蛋白和紅細(xì)胞輕度或中度降低，發(fā)生危象時(shí)可呈重度；白細(xì)胞和血小板正常；網(wǎng)織紅細(xì)胞升高；MCV和MCH多正常，MCHC可增加[11-12]。該患者入院時(shí)發(fā)熱、乏力，血紅蛋白重度減少，考慮感染引起的溶血危象導(dǎo)致全血細(xì)胞減少。給予對(duì)癥處理，治療過(guò)程中感染好轉(zhuǎn)，白細(xì)胞降低至正常值，血小板升高但仍低于正常值，貧血依舊，考慮溶血性貧血。因其血小板低于正常值，紅細(xì)胞滲透脆性試驗(yàn)正常，均與溶血性貧血不符，故外送患者外周血標(biāo)本進(jìn)行基因檢測(cè)。

該病例全血細(xì)胞減少，臨床表現(xiàn)不典型，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查均無(wú)法明確診斷，因此進(jìn)一步完善基因檢測(cè)對(duì)疾病精準(zhǔn)診斷具有重要意義。初診時(shí)表現(xiàn)為全血細(xì)胞減少，為大細(xì)胞性貧血，葉酸和維生素B12為正常低值，考慮到有可能是營(yíng)養(yǎng)不良貧血，試驗(yàn)性地補(bǔ)充葉酸和維生素B12后, 血象有明顯改善，可知患者有營(yíng)養(yǎng)不良因素存在，且存在病態(tài)造血，感染體征，脾臟腫大等，故考慮不除外MDS。后加用環(huán)孢素治療后感染好轉(zhuǎn)但依舊貧血，且根據(jù)基因檢測(cè)結(jié)果可知，該患者為SPTB基因的致病性變異，不符合MDS的診斷標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)HS的發(fā)病機(jī)制，尤其在溶血時(shí)可以出現(xiàn)葉酸和維生素B12缺乏，可考慮為不典型HS。根據(jù)SWISS-MODEL軟件對(duì)SPTB基因突變進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知，c.5551C>T(p.Q1851X) 位點(diǎn)變異導(dǎo)致蛋白截?cái)嗤蛔?，SPTB基因突變可能使β-血影蛋白缺乏，破壞了紅細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，導(dǎo)致紅細(xì)胞破壞, 也可說(shuō)明該患者為HS。因HS中無(wú)血小板減少，所以需進(jìn)一步隨診監(jiān)測(cè)，隨診：患者行脾臟切除術(shù)，術(shù)后3個(gè)月復(fù)查血常規(guī)均正常。

綜上所述，HS患者的臨床表現(xiàn)無(wú)特異性，部分臨床表現(xiàn)不典型發(fā)作的HS診斷具一定挑戰(zhàn)性，排除其他溶血性貧血及其他相關(guān)因素后，建議考慮HS。此外，本研究發(fā)現(xiàn)SPTB基因的1個(gè)未見(jiàn)報(bào)道的突變，豐富了該基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)，為進(jìn)一步探索HS的遺傳學(xué)病因提供參考。