李昌哲，洪秋月，李軍，楊光紅，趙華，胡婷**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 毒性檢測(cè)中心，貴州 貴陽(yáng) 550025;2．貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025;3．貴州醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院 環(huán)境衛(wèi)生與職業(yè)衛(wèi)生教研室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

瑞香狼毒俗稱狼毒、斷腸草等，是瑞香科狼毒屬植物，其成分主要包含香豆素、黃酮、二萜原酸酯以及木脂素類等化合物[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載，瑞香狼毒有“主咳逆上氣，破積聚，惡瘡，鼠瘺疽蝕”等功效[2]；現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，瑞香狼毒素在抗腫瘤、抗HIV以及抗菌等方面有生理活性[3-5]。近年來(lái)，瑞香狼毒素被廣泛用于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治、抗真菌抗螨蟲(chóng)的藥劑開(kāi)發(fā)中[6-7]，與人的接觸機(jī)會(huì)增加，雖然瑞香狼毒素的藥用價(jià)值明顯，但其潛在風(fēng)險(xiǎn)也不應(yīng)被忽視。有報(bào)道提出瑞香狼毒素屬低毒物質(zhì)，具有一定胃毒毒性[8-9]，可引發(fā)腹瀉、皮疹等不良反應(yīng)[10]。瑞香狼毒素引起的胃腸道毒性作用究竟有多嚴(yán)重，轉(zhuǎn)歸如何鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究針對(duì)這一問(wèn)題展開(kāi)研究，以期為瑞香狼毒素制劑的合理使用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康斷乳的SPF級(jí)SD大鼠，體質(zhì)量100～120 g，共50只，雌雄各半，購(gòu)于貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(黔)2017-0027。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 瑞香狼毒素(有效成分含量為20%)，由貴州醫(yī)科大學(xué)毒性檢測(cè)中心提供；胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)Ⅰ(PGⅠ)和Ⅱ(PGⅡ)生化套裝，購(gòu)自浙江寧波瑞源生物科技有限公司；一抗縫隙連接蛋白43(connexin43，CX43)，購(gòu)自abcam(批號(hào)GR3271571-13)；內(nèi)參β-actin，購(gòu)自bioss(批號(hào)AH01032107)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、切片機(jī)、全自動(dòng)染色機(jī)、光學(xué)顯微鏡均為德國(guó)徠卡；全自動(dòng)生化分析儀(AU400，日本奧林巴斯)、超級(jí)酶標(biāo)儀(MQX200，美國(guó)Bio-Tek公司)、高速冷凍離心機(jī)(5417R，德國(guó)Eppendorf公司)、凝膠成像儀(Chemi DocTMXRS+，美國(guó)Bio-Rad公司)、基礎(chǔ)電泳儀(PowerPacTM，美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物分組和處理 50只SD大鼠經(jīng)檢疫和適應(yīng)性喂養(yǎng)后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將其分為5組，每組10只，雌雄各半。對(duì)照組給予去離子水灌胃90 d。低、中、高劑量組：瑞香狼毒素溶于去離子水，染毒劑量分別為31.25、125.00、500.00 mg/kg，灌胃90 d?；謴?fù)組：瑞香狼毒素按500 mg/kg染毒劑量灌胃90 d后，不做任何處理再飼養(yǎng)7 d；以上各組每周灌胃6 d(每日1次)休息1 d，灌胃劑量為10 mL/kg。

1.2.2標(biāo)本采集及保存 實(shí)驗(yàn)終期，采用7%水合氯醛麻醉大鼠，心臟采集非抗凝血2 mL，分離血清用于生化指標(biāo)測(cè)定；將動(dòng)物解剖后取胃，沿胃大彎剪開(kāi)，生理鹽水清洗干凈，觀察胃黏膜的大體損傷情況，取損傷最嚴(yán)重的部位進(jìn)行固定，用于之后的組織病理學(xué)檢察，同時(shí)在此部位取胃壁組織0.02 g加預(yù)冷裂解液200 μL勻漿,12 000 r/min低溫離心5 min,取上清液用于蛋白表達(dá)量測(cè)定。

1.2.3指標(biāo)測(cè)定 (1)大鼠一般情況觀察及體質(zhì)量測(cè)量：實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察并記錄動(dòng)物的一般表現(xiàn)、行為和死亡情況，每周稱重兩次，計(jì)算各時(shí)間段的體質(zhì)量增長(zhǎng)率，體質(zhì)量增長(zhǎng)率(%)=[(后一時(shí)間點(diǎn)的體質(zhì)量-前一時(shí)間點(diǎn)的體質(zhì)量)/前一時(shí)間點(diǎn)的體質(zhì)量]×100%;(2)血清指標(biāo)檢測(cè)：采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測(cè)血清PGⅠ和PGⅡ含量;(3)胃組織病理學(xué)檢察：胃組織固定 48 h后，按常規(guī)方法制片，蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色、光鏡下檢查組織形態(tài)結(jié)構(gòu);(4)胃組織勻漿CX43的測(cè)定：使用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)測(cè)定胃組織勻漿蛋白濃度，根據(jù)蛋白濃度決定上樣量；依次進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，兔抗大鼠單克隆抗體(1/2 000)4 ℃孵育過(guò)夜后，辣根酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1/3 000)室溫下孵育2 h，充分洗滌后ECL化學(xué)發(fā)光顯影，使用凝膠成像儀拍攝圖像并分析各條帶的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

實(shí)驗(yàn)期間高劑量組大鼠的活動(dòng)程度明顯減弱、精神狀態(tài)呈低度萎靡，皮膚毛發(fā)較光澤、順整，飲食減少、飲水量增多，大便基本成型，尿量增多、色黃，其余各組一般情況表現(xiàn)與對(duì)照組比較，無(wú)明顯差異。

2.2 各組大鼠體質(zhì)量和體質(zhì)量增長(zhǎng)率

與對(duì)照組相比，5～8周低、中、高劑量組大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)率下降，9～13周高劑量組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1和表1。

圖1 瑞香狼毒素連續(xù)給藥90 d各組大鼠的體質(zhì)量變化Fig.1 Weight changes of rats treated with S. chamaejasme for 90 days

表1 各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)率比較Tab.1 Comparison of weight growth rate

2.3 血清PGI和 PGII

與對(duì)照組相比，中、高劑量組大鼠血清PGI降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與低劑量組相比，高劑量組PGI分泌量降低(P<0.05)；與對(duì)照組相比，高劑量組血清PGII含量降低(P<0.05)，低、中、高劑量組大鼠PGI /PGII比值降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與高劑量組相比，恢復(fù)組血清PGI、PGII含量和PGI /PGII比值變化不明顯(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清中PGI、PGII和PGI/PGII比值Tab.2 The serum PGI,PGII,and PGI /PGII proportion of rats in each

2.4 胃組織學(xué)觀察

對(duì)照組大鼠皮胃黏膜覆蓋復(fù)層鱗狀上皮，黏膜下富含血管；腺胃為單層柱狀上皮，固有層含大量腺體，腺體間為少量結(jié)締組織。高劑量組大鼠的胃黏膜上皮缺損，上皮反應(yīng)性不典型增生與上皮細(xì)胞黏蛋白和纖維蛋白的滲出混合，胃腺萎縮和纖維化，基底部炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分被纖維包裹。恢復(fù)組的病變情況和高劑量組基本一致。見(jiàn)圖2。

圖2 各組大鼠胃組織學(xué)觀察(HE,×100)Fig.2 Histology observation of gastric tissue of each group (HE,×100)

2.5 胃組織細(xì)胞CX43表達(dá)

與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組胃組織勻漿CX43蛋白表達(dá)量下降(P<0.05)；與低劑量組相比，中、高劑量組胃組織勻漿CX43蛋白表達(dá)量下降(P<0.05)；與中劑量組相比，高劑量組胃組織勻漿CX43蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.05)；與高劑量組相比，恢復(fù)組胃組織勻漿CX43蛋白表達(dá)量變化并不明顯(P>0.05)。見(jiàn)圖3。

注：(1)與對(duì)照組相比，P<0.05；(2)與低劑量組相比，P<0.05；(3)與中劑量組相比，P<0.05。圖3 各組大鼠胃組織胃組織勻漿CX43蛋白表達(dá)Fig.3 CX43 protein expression on the stomach of rats in each group

3 討論

隨著醫(yī)藥事業(yè)快速發(fā)展，對(duì)瑞香狼毒素的研究和利用越來(lái)越廣泛，成績(jī)顯著。瑞香狼毒素除了在癌癥治療方面的積極貢獻(xiàn)外[11-12]，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)瑞香狼毒素可用于治療高脂血癥[13-14]。Jo等[15]采用狼毒治療特異性皮炎，可有效改善特應(yīng)性皮膚癥狀。市售多種抗真菌的中藥搽劑，都含有瑞香狼毒素[16]。瑞香狼毒素還被廣泛應(yīng)用于多種有害生物的防治，比如蚜蟲(chóng)、菜青蟲(chóng)、飛蝗、線蟲(chóng)、斑潛蠅以及螨蟲(chóng)[17-19]。

人們?cè)趯?duì)瑞香狼毒素的藥理藥性研究中較多關(guān)注它積極的一方面，缺乏對(duì)其危害性的研究。本實(shí)驗(yàn)研究顯示，較長(zhǎng)時(shí)間經(jīng)口接觸低濃度的瑞香狼毒素雖不會(huì)引起動(dòng)物死亡，但會(huì)給動(dòng)物的臟器及其功能帶來(lái)不利影響，本研究中主要觀察了其對(duì)胃的影響。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，體質(zhì)量作為非特異性的常規(guī)觀測(cè)指標(biāo)，能大體反映外源性物質(zhì)對(duì)動(dòng)物機(jī)體的毒性效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，從染毒第5周開(kāi)始，中、高劑量組動(dòng)物體重明顯低于正常組。隨著染毒時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加，中、高劑量組體重增長(zhǎng)率明顯下降，尤以高劑量組為甚。結(jié)合染毒期間中、高劑量組大鼠出現(xiàn)不同程度被毛光澤暗淡、精神萎靡、活動(dòng)減少、反應(yīng)遲鈍等癥狀，表明染毒大鼠出現(xiàn)不同程度的中毒效應(yīng)。

病理學(xué)檢查對(duì)于組織器質(zhì)性病變的判斷是其它任何方法無(wú)法替代的[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，高劑量組大鼠的胃發(fā)生了不同程度的病理組織學(xué)改變：胃黏膜上皮缺損，上皮反應(yīng)性不典型增生，上皮細(xì)胞黏蛋白和纖維蛋白的滲出混合，胃腺萎縮，基底部炎細(xì)胞浸潤(rùn)，部分被纖維包裹。這說(shuō)明較長(zhǎng)期高濃度瑞香狼毒素染毒的大鼠胃組織結(jié)構(gòu)會(huì)遭到破壞，存在反復(fù)發(fā)作的潰瘍，胃腺萎縮。

在反映胃黏膜功能和狀態(tài)方面，PG水平是一個(gè)很重要的參考指標(biāo)[21]。其中PGI能檢測(cè)胃泌酸腺細(xì)胞功能，胃酸分泌增多時(shí)PGI升高，分泌減少或腺體萎縮時(shí)PGI則降低；PGII則與胃底粘膜的病變相關(guān)性較大，胃底腺管萎縮、胃上皮化生或假幽門腺化生、異型增殖都會(huì)使其升高；PGI/PGII比值進(jìn)行性降低，代表胃粘膜發(fā)生了萎縮，當(dāng)降低到一定低值，并且PGI也降低到某個(gè)值時(shí)，提示有罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著瑞香狼毒素染毒劑量的增加，與對(duì)照組相比，PGI的含量逐漸降低，PGⅡ也在降低，在高劑量組降低最明顯，同時(shí)PGI/PGII比值也在進(jìn)行性降低，高劑量組最明顯，提示胃腺萎縮在進(jìn)行性加劇，這與病理學(xué)檢查結(jié)果基本一致。

CX43在胃粘膜遭受破壞的早期，作為應(yīng)激狀態(tài)下胃粘膜細(xì)胞間的快速反應(yīng)因子，對(duì)應(yīng)激狀態(tài)下胃粘膜細(xì)胞凋亡和增殖產(chǎn)生影響，在維持胃粘膜細(xì)胞正常的生理生化功能方面起著重要作用[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，低劑量組的CX43蛋白含量已經(jīng)較正常組發(fā)生了明顯下降，隨染毒時(shí)間和劑量增加，CX43還在持續(xù)下降。說(shuō)明CX43的反應(yīng)很靈敏，在蛋白層面是最先被破壞的一類物質(zhì)，并且隨染毒劑量的增加，這種破壞還在加劇。

CX43作為細(xì)胞間隙連接的結(jié)構(gòu)蛋白，可以偶聯(lián)其它細(xì)胞，及時(shí)將化學(xué)信號(hào)、電信號(hào)、能量物質(zhì)通過(guò)間隙連接迅速流向其它細(xì)胞[23]。本實(shí)驗(yàn)中，CX43含量的變化，并沒(méi)有立即引發(fā)PGI和PGII的變化，直到高劑量組，PGI、PGII含量和PGI/PGII比值全部發(fā)生明顯的變化，相關(guān)性分析也提示了這一點(diǎn)。說(shuō)明胃腺體發(fā)揮了部分代償能力。

本實(shí)驗(yàn)中設(shè)置了恢復(fù)組，安排了7 d的恢復(fù)期，雖然時(shí)間不長(zhǎng)，不足以使病理改變發(fā)生明顯變化，但其PGI、PGII分泌量和CX43蛋白表達(dá)量這些隨情況的變化能在早期發(fā)生改變的指標(biāo)，與高劑量組比較，也沒(méi)有發(fā)生變化，說(shuō)明暴露因素雖消除，但之前的暴露在體內(nèi)發(fā)生了蓄積，并且該物質(zhì)的半衰期較長(zhǎng)，這與何華紅等[24]研究結(jié)果類似。

綜上所述，瑞香狼毒素較長(zhǎng)期染毒會(huì)對(duì)大鼠胃組織造成損害，引起廣泛性的胃慢性萎縮，這種損害可能與CX43表達(dá)被抑制有關(guān)，并且瑞香狼毒素可以在機(jī)體發(fā)生蓄積，對(duì)于機(jī)體的損害會(huì)持續(xù)較長(zhǎng)一段時(shí)間。由此可見(jiàn)，瑞香狼毒這把雙刃劍，在使用時(shí)一定要注意量和時(shí)間的問(wèn)題，在日常生活中，也要盡量少接觸。