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        西地那非對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓中Notch- 1/Jagged- 1通路的影響研究

        2021-12-14 07:27:54向貽佳蔡昌宏吳勇輝葉士勇趙歡曾春來
        心電與循環(huán) 2021年6期
        關(guān)鍵詞:模型

        向貽佳 蔡昌宏 吳勇輝 葉士勇 趙歡 曾春來

        肺動脈高壓是一種以肺動脈壓力升高、右心室肥厚及右心衰竭為特征的惡性血管疾病[1]。目前認為肺血管重塑在肺動脈高壓病理發(fā)生發(fā)展中起著重要作用,其病理過程涉及肺小動脈內(nèi)膜纖維化、中膜肥厚以及管腔狹窄[2-3]。其中Notch 信號通路在肺動脈重塑過程中起著重要作用[4-5]。研究已經(jīng)證實西地那非能通過抑制磷酸二酯酶、發(fā)揮內(nèi)皮保護作用等改善肺動脈高壓[6-8]?;贜otch 信號通路及西地那非在肺動脈平滑肌細胞重塑中的作用,本文探討西地那非對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓血管重塑過程中Notch-1/Jagged-1 信號通路的影響,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

        1 材料和方法

        1.1 實驗動物和試劑 選擇雄性SD 大鼠(年齡6~8 周,體重250~300 g)42 只,購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心,飼養(yǎng)在無特定病原體級環(huán)境中,溫度(21±1)℃,濕度(55±5)%,給予標準飲食及飲用水。野百合堿(C2401) 購自美國Sigma 公司,Notch-1 抗體(ab52627) 購自英國Abcam 公司、Hes-1 抗體(ab71559) 購自英國Abcam 公司、Jagged-1 抗體(ab7771) 購自英國Abcam 公司、α-SMA 抗體(ab5694) 購自英國Abcam 公司、GAPDH 抗體(5174S)購自美國Cell Signaling Technology 公司。

        1.2 方法

        1.2.1 動物造模及給藥 42 只大鼠采用隨機數(shù)字表法分成3 組,模型組16 只、西地那非組16 只及對照組10 只。模型組及西地那非組大鼠一次性背部皮下注射野百合堿溶液60 mg/kg 建立肺動脈高壓模型,對照組背部皮下注射0.8 mL 0.9%氯化鈉注射液。造模3 周后西地那非組予西地那非100 mg·kg-1·d-1灌胃,連續(xù)2 周,每周測體重1 次,根據(jù)大鼠體重調(diào)整西地那非用量(100mg·kg-1·d-1)。西地那非給藥期間,模型組及對照組予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。

        1.2.2 右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure,RVSP)及右心肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index,RI)測定 至給藥第5 周末,存活大鼠用4%水合氯醛麻醉后固定,剪去頸部毛發(fā),依次切開皮膚、皮下組織,分離右側(cè)頸外靜脈,結(jié)扎遠心端,采用右心導(dǎo)管法,Medlab 生物信號記錄儀記錄RVSP。測壓結(jié)束后,自右心室導(dǎo)管注入10%氯化鉀溶液處死動物,分離心臟及肺。剪去心房,分離右心室和左心室+ 室間隔,分別稱重,計算RI。RI= 右心室質(zhì)量/(左心室質(zhì)量+ 室間隔質(zhì)量)。右肺置于4%多聚甲醛中固定,其余肺立即置于-80 ℃冰箱中保存。

        1.2.3 肺組織肺小動脈病理檢查 右肺組織在4%多聚甲醛中固定72 h 后,取右肺上葉組織經(jīng)過不同濃度乙醇脫水、二甲苯透明及石蠟包埋,切成3~5 μm薄片。采用HE 和Masson 染色方法觀察肺小動脈形態(tài)及纖維化情況。

        1.2.4 Notch-1、Hes-1、Jagged-1 及α-SMA 表達水平的檢測 取冰凍的肺組織100 mg (每組6 個樣本),以冰PBS 漂洗3 次,剪成細小的碎片,按每20 mg 組織加入150~250 μL 裂解液的比例,加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的組織細胞快速裂解液,采用勻漿器勻漿直至肺組織完全裂解。將裂解后的樣品以4 ℃12 000 g 離心15 min,取上清液,用蛋白定量法進行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃冰箱。經(jīng)過配膠(10%分離膠分離膠+ 濃縮膠)、上樣(每孔蛋白80 μg)、電泳、轉(zhuǎn)膜、化學(xué)發(fā)光檢測靶蛋白條帶,軟件分析灰度值,與內(nèi)參GAPDH 比較,得出靶蛋白Notch-1、Hes-1、Jagged-1 及α-SMA 相對含量。

        1.2.5 肺小動脈中α-SMA 表達水平的檢測 石蠟切片通過脫蠟、水化及PBS 漂洗后,隨后進行抗原修復(fù)與阻斷,孵育α-SMA 抗體及二抗,蘇木素復(fù)染,清洗,脫水及封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肺小動脈染色情況。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graph Pad Prism(vision 7.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用Tukey 檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 3 組大鼠RVSP 及RI 比較 第5 周末,模型組、西地那非組及對照組存活大鼠分別為8、10、8只。3 組大鼠RVSP 及RI 比較見表1。

        由表1 可見,模型組RVSP 和RI 均高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。西地那非組RVSP 和RI 均低于模型組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

        表1 3 組大鼠RVSP 及RI 比較

        2.2 3 組大鼠肺小動脈病理檢查結(jié)果比較 見圖2(見封三)。

        由圖2 可見,HE 及Masson 染色顯示,與對照組比較,模型組肺小動脈明顯增厚、纖維化增加。西地那非組肺小動脈結(jié)構(gòu)異常較模型組改善。

        2.3 3 組大鼠肺組織中靶蛋白Notch-1、Hes-1 以及Jagged-1 表達比較 見圖3。

        由圖3 可見,模型組Notch-1、Hes-1 及Jagged-1表達水平均高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)。西地那非組Notch-1、Hes-1 及Jagged-1表達水平均低于模型組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

        圖3 3 組大鼠肺組織中靶蛋白Notch-1,Hes-1 以及Jagged-1 表達比較(A:3 組大鼠Notch-1、GAPDH 蛋白電泳圖及Notch-1/GAPDH 柱狀圖;B:3 組大鼠Hes-1、GAPDH 蛋白電泳圖及Hes-1/GAPDH 柱狀圖;C:3 組大鼠Jagged-1、GAPDH 蛋白電泳圖及Jagged-1/GAPDH 柱狀圖;*P<0.05,**P<0.01)

        2.4 3 組大鼠肺小動脈α-SMA 蛋白表達比較 見圖4(見封三)。

        由圖4 可見,模型組α-SMA 表達水平高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。西地那非組α-SMA 表達水平低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

        圖4 3組大鼠肺小動脈α-SMA 蛋白表達比較(A:3 組大鼠肺小動脈α-SMA 免疫組化,×400;B:3 組大鼠α-SMA、GAPDH 蛋白電泳圖;C:3 組大鼠α-SMA/GAPDH 柱狀圖;**P<0.01)

        3 討論

        肺動脈高壓是一種嚴重的惡性血管疾病,本研究采用皮下注射野百合堿溶液建立肺動脈高壓模型。本研究結(jié)果表明,野百合堿注射5 周后RVSP 及RI 明顯升高,提示成功建立野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型。西地那非干預(yù)后,RVSP 及RI 明顯下降,說明西地那非可改善肺動脈高壓,研究結(jié)果與其他研究結(jié)果一致[9-12]。本研究還觀察發(fā)現(xiàn),建模后肺小動脈明顯增厚、纖維化增加,而西地那非干預(yù)后上述表現(xiàn)得到改善。

        目前已知肺血管重塑在肺動脈高壓形成過程中起著關(guān)鍵作用,涉及細胞肥厚、增殖、遷移、凋亡及細胞外基質(zhì)沉積等病理改變。多種細胞及細胞因子參與血管重塑。近年來,研究發(fā)現(xiàn)Notch 信號通路在細胞凋亡及血管重構(gòu)中起著重要作用[13-16],且Notch 信號通路也參與了肺動脈高壓形成病理過程[17-19]。Notch信號通路包括4 種受體(Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4) 和5 種 跨膜 配 體(Jagged-1、Jagged-2、Delta-like 1、Delta-like 2、Delta-like 3)[20-21]。研究表明,Notch 受體1、3 和4 以及配體Dll4、Jagged-1 和Jagged-2 在動脈系統(tǒng)中高度表達,對維持正常血管結(jié)構(gòu)、凋亡及血管重構(gòu)起著重要作用[16]。受體胞外區(qū)和相鄰細胞上的配體結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象改變,暴露蛋白水解酶切位點,Notch 胞內(nèi)段經(jīng)分解酶水解進入細胞核并與重組信號結(jié)合蛋白J 結(jié)合調(diào)節(jié)下游靶基因(Hes/Hey,ERBB2,Id 等),從而發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型Notch-1、Jagged-1 及Hes1 蛋白表達明顯增加,西地那非可抑制上述蛋白的表達。此外,血管平滑肌中α-SMA 表達水平在肺動脈高壓模型中明顯升高,而西地那非干預(yù)后可抑制其表達。 本研究進一步證實Notch-1/Jagged-1 信號通路參與野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓形成過程,而西地那非能夠抑制野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓中Notch-1/Jagged-1 信號通路。

        綜上所述,Notch-1/Jagged-1 信號通路在野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓中活化,而西地那非能夠抑制肺動脈高壓中Notch-1/Jagged-1 信號通路,為西地那非用于治療包括肺動脈高壓在內(nèi)的血管重構(gòu)性疾病提供了實驗基礎(chǔ)。但本研究存在不足之處,西地那非是否通過Notch-1/Jagged-1 信號通路直接作用于肺動脈平滑肌細胞,從而抑制肺動脈重構(gòu)仍有待進一步體內(nèi)外實驗證實。

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