馬慧敏，孫培琳，馬春泉

（1黑龍江大學農(nóng)業(yè)微生物技術教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學生命科學學院/黑龍江省普通高校分子生物學重點實驗室，哈爾濱 150080）

0 引言

鹽脅迫是一種主要的非生物脅迫，其中滲透脅迫和離子損傷被認為是造成植物傷害的2個主要因素[1]。甜菜(Beta vulgaris)是藜科二年生草本植物，原產(chǎn)于歐洲，從瑞典移栽到西班牙后開始大范圍栽培，變異很大，被分為若干亞種、變種及變型，是除甘蔗以外主要糖的來源之一[2-3]。它具有耐鹽、耐堿、耐旱、耐寒等特點，是一種適應性強、抗逆性強、經(jīng)濟價值高的作物[4]。甜菜M14品系是郭德棟利用二倍體栽培甜菜(B.vulgaris)和四倍體野生白花甜菜(B.corollifiora)雜交并回交后得到的帶有白花甜菜第9號染色體的單體附加系，可以在500 mmol/L NaCl中存活，是挖掘優(yōu)質(zhì)耐鹽基因資源的良好材料[5-6]。實驗室前期已經(jīng)克隆獲得了鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組中上調(diào)表達基因BvM14-GAI的cDNA全長，并進行了生物信息學分析，亞細胞定位研究表明其定位在細胞核中[7]。

GAI蛋白屬于植物特有的轉(zhuǎn)錄因子GRAS家族中DELLA亞家族[8]。GRAS家族是近年來發(fā)現(xiàn)的一種植物特異性的蛋白家族，DELLA雖然為轉(zhuǎn)錄因子GRAS家族，但不具有DNA結(jié)合域，通常與其他轉(zhuǎn)錄因子互作共同轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用[9-10]。DELLA通過與WRKY6相互作用，對黑暗誘導擬南芥葉片衰老和葉綠素降解負調(diào)控，從而抑制衰老相關基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與植物黑暗誘導[11]。Serrano-Mislata等[12]揭示了DELLA通過直接上調(diào)潛在分生組織中的細胞周期抑制劑KRP2來限制擬南芥的分生組織大小，說明DELLA蛋白在控制莖的生長方面具有重要作用。Zhou等[13]在擬南芥響應低溫脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，DELLA蛋白正向調(diào)控冷誘導基因CBF3參與到茉莉酸(JA)信號途徑，兩者共同作用延緩植物生長來提高擬南芥應答低溫脅迫能力。

目前，許多植物的GAI基因已被克隆，但其功能研究主要集中在光響應機制領域，在響應非生物脅迫機制的研究報道較少。本研究在前期工作基礎上，通過轉(zhuǎn)化擬南芥開展BvM14-GAI基因的耐鹽功能研究，對GAI基因響應非生物脅迫的功能進行拓展，以期闡明甜菜M14品系耐鹽分子機制和培育耐鹽作物品系。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料 擬南芥哥倫比亞野生型，TAIR(http://www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站購買擬南芥GAI基因突變株(AT1G71200)。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α菌株、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株、植物表達載體35S::pCAMBIA1300。

1.1.3 試劑及引物 主要試劑甜菜堿、超氧化物歧化酶、過氧化物酶測定試劑盒均購自蘇州格銳思生物科技有限公司。引物包括35S::pCAMBIA1300-BvM14-GAI植物 表 達 載 體 引 物 (GAI-5-S：5'-ACGAATTCGAGCTCGATGAAGAGGGAACACCCC T-3'，GAI-5-AS：5'-CTAGAGGATCCCCGGTCAACG ATGAGTTGGCGAGT-3')、半定量RT-PCR引物（GAI-6-S：5'-ATCCGAAAACGGGTCGTTGA-3'，GAI-6-AS：5'-ATCCGAAAACGGGTCGTTGA-3'）、擬南芥突變株篩選引物（GAI LP：5'-AAGCGATTCTCGAAGCTTTT C-3'，GAI RP：5'-TGCCTATCCAATTTACCCTCC-3'，LbA1：5'-TGGTTCACGTAGTGGGCCAT-3'），引物合成與測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 表達載體35S::pCAMBIA1300-BvM14-GAI的構建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 以實驗室前期所得質(zhì)粒pMD18-TBvM14-GAI為模板，利用引物GAI-5-S、GAI-5-AS進行BvM14-GAI基因的擴增，PCR反應條件為：94℃4 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，30個循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保存。利用In-Fusion技術將帶有BamHⅠ酶切位點的BvM14-GAI基因與酶切后的pCAMBIA1300載體進行重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，提取質(zhì)粒測序。堿裂解法提取重組質(zhì)粒35S::pCAMBIA1300-BvM14-GAI，經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

1.2.2 擬南芥異源表達植株及異源互補植株的獲得 將BvM14-GAI序列在TAIR網(wǎng)站進行同源性比對，選擇相似性最高且結(jié)構域DELLA和GRAS保守的擬南芥GAI基因突變株(AT1G71200)并購買。將購買的擬南芥突變株種子種植在1/2MS培養(yǎng)基上，待出芽后移入土壤（草炭土:蛭石=1:1）中培養(yǎng)，待擬南芥突變株長出3～5對葉片時提取基因組總DNA作為模板，利用突變株檢測引物GAI LP、GAI RP和LBA 1，進行PCR擴增，篩選獲得純合突變植株。反應條件：94℃4 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 90 s，35個循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保存。

利用花序浸染法將BvM14-GAI基因轉(zhuǎn)化擬南芥野生型植株(WT)和GAI基因突變株(KO)，成熟后收取種子在含30 mg/L Hyg的1/2MS固體培養(yǎng)基上篩選，獲得幼苗轉(zhuǎn)移至土壤（草炭土:蛭石=1:1）培養(yǎng)至成苗。對轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株進行基因組PCR和RT-PCR的檢測，篩選確定陽性擬南芥植株。提取轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為模板，利用基因特異引物GAI-5-S和GAI-5-AS進行PCR擴增，反應條件94℃ 4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s，30個循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保存。

采用RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)化植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板，GAI-6-S和GAI-6-AS為引物進行RT-PCR擴增，利用18S rRNA基因作為內(nèi)參基因，反應條件：94℃4 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，30 個循環(huán) ；72℃ 7 min；4℃保存。直至獲得T3代BvM14-GAI擬南芥異源表達和異源互補植株純合株系。

1.2.3 T3代陽性擬南芥異源表達植株和異源互補植株的表型觀察及測定 分別將野生型擬南芥(WT)、GAI基因突變株(KO)、BvM14-GAI基因異源表達植株(OX)和BvM14-GAI基因異源互補植株(CO)4種植株種子種植在1/2MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，轉(zhuǎn)移至含有150 mmol/L NaCl的1/2MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)14天，進行表型觀察，以0 mmol/L NaCl處理為對照，并測定植株根長、鮮重和干重，每次測定進行3次生物學重復。

1.2.4 K+、Na+和甜菜堿含量測定 將1.2.3中0 mmol/L NaCl處理下的4種植株(WT、KO、OX、CO)轉(zhuǎn)移至土壤（草炭土:蛭石=1:1）長日照（16 h光/8 h暗）下正常培養(yǎng)，待植株生長至4～6對葉片時，用150 mmol/L NaCl溶液澆灌脅迫處理，每天處理1次，共3次。取處理前后的擬南芥葉片進行K+、Na+含量測定，每次測定進行3次生物學重復，計算K+/Na+比。

取處理前后的擬南芥葉片烘干后過60目篩的樣品約0.02 g，加1 mL 80%甲醇溶液，置于60℃提取30 min，不斷震蕩，然后12000 r/min，25℃離心15 min，取上清液進行甜菜堿含量測定，每次測定進行3次生物學重復，測定方法參考蘇州格銳思生物科技有限公司的甜菜堿(betaine)含量試劑盒說明書。

1.2.5 SOD、POD含量測定 取1.2.4中150 mmol/L NaCl脅迫前后擬南芥植株葉片，測定SOD、POD含量，進行3次生物學重復。測定方法參考蘇州格銳思生物科技有限公司的超氧化物歧化酶(SOD)-WST法-分光法-96樣說明書、過氧化物酶(POD)-WST法-分光法-96樣說明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對原始數(shù)據(jù)進行標準化處理，采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進行繪圖，用GraphPad Prime 6軟件進行方差分析，差異顯著性閾值為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 構建pCAMBIA1300-BvM14-GAI植物表達載體及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

根據(jù)1.2.1方法，隨機選取5個重組陽性菌落進行PCR驗證，結(jié)果如圖1所示，均擴增出與目的基因大小一致的條帶。提取質(zhì)粒進行測序，結(jié)果顯示pCAMBIA1300-BvM14-GAI表達載體構建成功，進一步轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105用于浸染擬南芥。

圖1 35S::pCAMBIA1300-BvM14-GAI重組質(zhì)粒特異引物PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 T3代BvM14-GAI基因擬南芥異源表達植株及異源互補植株的獲得

隨機選取12株擬南芥GAI基因突變株提取基因組DNA，并利用TAIR網(wǎng)站提供的突變株檢測引物對擬南芥GAI基因突變株進行三引物PCR鑒定，結(jié)果圖2所示，以野生型為對照，編號1、2、3、4、7、8、10、11的8個株系為擬南芥GAI基因突變株純合系，選取擬南芥GAI基因突變株純合系進行后續(xù)實驗。

圖2 擬南芥GAI基因突變株純合子篩選PCR篩選結(jié)果

參照1.2.2中的方法，對于浸染后獲得的擬南芥異源表達和異源互補植株，成熟后收取種子在含30 mg/L Hyg的1/2MS固體培養(yǎng)基上篩選（圖3），獲得幼苗轉(zhuǎn)移至土壤（草炭土:蛭石=1:1）培養(yǎng)至成苗，采用抗生素Hyg抗性篩選聯(lián)合基因組PCR及RT-PCR檢測T3代擬南芥植株。T3代擬南芥植株基因組PCR檢測如圖4所示，均含有目的條帶，說明BvM14-GAI基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥野生型和GAI基因突變株。RT-PCR轉(zhuǎn)錄水平檢測如圖5所示，參比WT和KO植株，OX和CO植株中均能檢測到BvM14-GAI基因條帶，說明該基因成功轉(zhuǎn)錄。獲得的T3代BvM14-GAI基因擬南芥異源表達植株(OX)和BvM14-GAI基因異源互補植株(CO)純合系，用于后續(xù)實驗。

圖3 BvM14-GAI基因異源表達及異源互補陽性擬南芥植株的抗性篩選(Hyg 30 mg/L)結(jié)果

圖4 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達植株及異源互補植株的PCR檢測結(jié)果

圖5 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達植株及異源互補植株的RT-PCR檢測結(jié)果

2.3 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達植株及異源互補植株鹽脅迫前后的表型觀察及測定

按1.2.3的方法對植株進行觀察及根長、鮮重、干重的測定，結(jié)果如圖6～7所示，0 mmol/L NaCl處理時，以WT、KO植株為對照，OX與CO植株根長顯著短于對照，表明BvM14-GAI基因?qū)ιL起負調(diào)控作用，為生長負調(diào)控因子。150 mmol/L NaCl處理后，OX與CO植株根長、鮮重、干重與對照組的差異均不顯著。

圖6 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達及異源互補植株鹽脅迫前后的表型及根長測定結(jié)果

圖7 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達及異源互補植株鹽脅迫前后的鮮重、干重測定結(jié)果

2.4 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達植株及異源互補植株鹽脅迫前后K+、Na+及甜菜堿含量的測定

由圖8A和8B可知，以WT和KO植株作為對照，OX與CO植株在150 mmol/L NaCl脅迫后K+/Na+與對照的差異均不顯著，維持了K+、Na+穩(wěn)態(tài)。由圖8C和8D可知，OX與CO植株150 mmol/L NaCl脅迫前后甜菜堿含量差異不顯著，但脅迫后甜菜堿含量比對照組略高。說明BvM14-GAI基因的轉(zhuǎn)入能夠維持K+、Na+穩(wěn)態(tài)，增加甜菜堿含量，改善植株的滲透調(diào)節(jié)能力，從而提高BvM14-GAI基因擬南芥異源表達植株及異源互補植株的耐鹽性。

圖8 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達及異源互補植株鹽脅迫前后K+/Na+及甜菜堿含量測定結(jié)果

2.5 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達植株及異源互補植株鹽脅迫前后SOD、POD活性

由圖9A和9C可知，150 mmol/L NaCl脅迫后OX植株SOD活性和POD活性均顯著高于WT；CO植株SOD活性和POD活性變化與OX植株表現(xiàn)相同趨勢（圖9B和9D）。說明BvM14-GAI基因的轉(zhuǎn)入增強了活性氧的清除能力，減少了NaCl帶來的氧化損傷，從而提高異源表達植株及異源互補植株的耐鹽性。

圖9 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達及異源互補植株鹽脅迫前后SOD、POD活性測定結(jié)果

3 結(jié)論

筆者構建了BvM14-GAI基因的植物表達載體，利用農(nóng)桿菌介導的花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥野生型和GAI基因突變株，通過對150 mmol/L NaCl脅迫下擬南芥異源表達和異源互補植株的表型和生理生化水平檢測分析，說明BvM14-GAI可以提高擬南芥異源表達植株及異源互補植株的耐鹽性。本研究結(jié)果對BvM14-GAI基因的生物學功能研究進行了有效補充，加深了甜菜M14品系耐鹽分子機理的研究，也為下一步甜菜耐鹽遺傳育種提供參考。

4 討論

GAI蛋白屬于GRAS家族中的DELLA亞家族，目前GAI基因序列已經(jīng)在多種植物中克隆，在植物的生長發(fā)育、光信號傳導通路、激素信號通路和對逆境響應的生理過程中發(fā)揮著重要的作用[14]，但甜菜中GAI基因功能研究尚未開展。Patrick等[15]曾發(fā)現(xiàn)鹽脅迫處理擬南芥DELLA四缺突變體(GAI、RGA、RGL1、RGL2)與擬南芥野生型時，DELLA四缺突變體的存活率顯著低于野生型；也有研究表明，擬南芥DELLA蛋白含量多時，植物耐鹽性增強[16]。DELLA蛋白作為赤霉素(GA)調(diào)節(jié)植物生長過程的負反饋蛋白，對大豆的生長發(fā)育以及開花起阻遏作用，同時DELLA蛋白也參與擬南芥幼苗的光形態(tài)建成[17-18]。本研究以擬南芥野生型植株(WT)和GAI基因突變株(KO)作為對照，0 mmol/L NaCl處理時，BvM14-GAI基因異源表達擬南芥植株(OX)根長顯著短于WT植株，異源互補擬南芥植株(CO)的根長也出現(xiàn)相同的表型，同樣影響了擬南芥幼苗形態(tài)建成，苗期生長趨勢緩慢，因而DELLA的過量積累會抑制植物的生長[19]；150 mmol/L NaCl處理后，相比WT和KO植株，OX、CO植株的根長與對照差異不顯著，因而DELLA蛋白的增加確實提高了擬南芥植株的耐鹽性。前期BvM14-GAI基因結(jié)構分析表明，甜菜M14品系中的GAI基因具有GRAS和DELLA 2個保守結(jié)構域，屬于GRAS家族中的DELLA亞家族，因而表現(xiàn)出相似的生物學功能[7]。

一般情況下，植物受到鹽脅迫時，主要是Na+過量累積造成離子毒害，Na+含量不斷增加導致K+含量呈下降趨勢，因而K+/Na+是衡量植物受到鹽脅迫損傷程度的重要指標之一，維持適宜的K+/Na+比是緩解植物鹽脅迫的關鍵所在[20]。本研究中150 mmol NaCl脅迫處理后，BvM14-GAI基因的異源表達維持了擬南芥細胞內(nèi)K+、Na+穩(wěn)態(tài)，增強了異源表達和異源互補擬南芥植株的耐鹽性。甜菜堿是保護植物免受非生物脅迫，如鹽[21-23]、干旱[24-25]、冷[26-27]、高溫[28-29]等最通用的滲透保護劑之一。相比WT和KO植株，150 mmol/L NaCl脅迫處理后OX和CO植株的甜菜堿含量均表現(xiàn)為增加，表明BvM14-GAI基因的轉(zhuǎn)入使擬南芥植株的滲透調(diào)節(jié)能力得到了改善，從而提高BvM14-GAI基因擬南芥異源表達植株及異源互補植株的耐鹽性。

當植物暴露于不利環(huán)境（如高鹽、干旱、高溫或寒冷）中時，通常以O2-和H2O2形式存在的ROS可以在植物中快速生成，過量的ROS會導致細胞成分（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和核酸）的氧化損傷[30]。較高的ROS水平也干擾蛋白質(zhì)合成和細胞膜，導致細胞和組織損傷。本研究中BvM14-GAI基因的異源表達均增加了SOD和POD酶的活性說明BvM14-GAI基因可能通過提高抗氧化酶系統(tǒng)和調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)，增強擬南芥異源表達及異源互補植株對ROS的清除能力和離子穩(wěn)態(tài)平衡，提高擬南芥異源表達及異源互補植株的耐鹽能力。