馬慧敏，孫培琳，馬春泉

（1黑龍江大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)教育部工程研究中心，哈爾濱 150500；2黑龍江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/黑龍江省普通高校分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150080）

0 引言

鹽脅迫是一種主要的非生物脅迫，其中滲透脅迫和離子損傷被認(rèn)為是造成植物傷害的2個(gè)主要因素[1]。甜菜(Beta vulgaris)是藜科二年生草本植物，原產(chǎn)于歐洲，從瑞典移栽到西班牙后開始大范圍栽培，變異很大，被分為若干亞種、變種及變型，是除甘蔗以外主要糖的來(lái)源之一[2-3]。它具有耐鹽、耐堿、耐旱、耐寒等特點(diǎn)，是一種適應(yīng)性強(qiáng)、抗逆性強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高的作物[4]。甜菜M14品系是郭德棟利用二倍體栽培甜菜(B.vulgaris)和四倍體野生白花甜菜(B.corollifiora)雜交并回交后得到的帶有白花甜菜第9號(hào)染色體的單體附加系，可以在500 mmol/L NaCl中存活，是挖掘優(yōu)質(zhì)耐鹽基因資源的良好材料[5-6]。實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)克隆獲得了鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組中上調(diào)表達(dá)基因BvM14-GAI的cDNA全長(zhǎng)，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，亞細(xì)胞定位研究表明其定位在細(xì)胞核中[7]。

GAI蛋白屬于植物特有的轉(zhuǎn)錄因子GRAS家族中DELLA亞家族[8]。GRAS家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種植物特異性的蛋白家族，DELLA雖然為轉(zhuǎn)錄因子GRAS家族，但不具有DNA結(jié)合域，通常與其他轉(zhuǎn)錄因子互作共同轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[9-10]。DELLA通過(guò)與WRKY6相互作用，對(duì)黑暗誘導(dǎo)擬南芥葉片衰老和葉綠素降解負(fù)調(diào)控，從而抑制衰老相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與植物黑暗誘導(dǎo)[11]。Serrano-Mislata等[12]揭示了DELLA通過(guò)直接上調(diào)潛在分生組織中的細(xì)胞周期抑制劑KRP2來(lái)限制擬南芥的分生組織大小，說(shuō)明DELLA蛋白在控制莖的生長(zhǎng)方面具有重要作用。Zhou等[13]在擬南芥響應(yīng)低溫脅迫的研究中發(fā)現(xiàn)，DELLA蛋白正向調(diào)控冷誘導(dǎo)基因CBF3參與到茉莉酸(JA)信號(hào)途徑，兩者共同作用延緩植物生長(zhǎng)來(lái)提高擬南芥應(yīng)答低溫脅迫能力。

目前，許多植物的GAI基因已被克隆，但其功能研究主要集中在光響應(yīng)機(jī)制領(lǐng)域，在響應(yīng)非生物脅迫機(jī)制的研究報(bào)道較少。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，通過(guò)轉(zhuǎn)化擬南芥開展BvM14-GAI基因的耐鹽功能研究，對(duì)GAI基因響應(yīng)非生物脅迫的功能進(jìn)行拓展，以期闡明甜菜M14品系耐鹽分子機(jī)制和培育耐鹽作物品系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 擬南芥哥倫比亞野生型，TAIR(http://www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站購(gòu)買擬南芥GAI基因突變株(AT1G71200)。

1.1.2 菌株及載體 大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α菌株、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105菌株、植物表達(dá)載體35S::pCAMBIA1300。

1.1.3 試劑及引物 主要試劑甜菜堿、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶測(cè)定試劑盒均購(gòu)自蘇州格銳思生物科技有限公司。引物包括35S::pCAMBIA1300-BvM14-GAI植物 表 達(dá) 載 體 引 物 (GAI-5-S：5'-ACGAATTCGAGCTCGATGAAGAGGGAACACCCC T-3'，GAI-5-AS：5'-CTAGAGGATCCCCGGTCAACG ATGAGTTGGCGAGT-3')、半定量RT-PCR引物（GAI-6-S：5'-ATCCGAAAACGGGTCGTTGA-3'，GAI-6-AS：5'-ATCCGAAAACGGGTCGTTGA-3'）、擬南芥突變株篩選引物（GAI LP：5'-AAGCGATTCTCGAAGCTTTT C-3'，GAI RP：5'-TGCCTATCCAATTTACCCTCC-3'，LbA1：5'-TGGTTCACGTAGTGGGCCAT-3'），引物合成與測(cè)序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體35S::pCAMBIA1300-BvM14-GAI的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 以實(shí)驗(yàn)室前期所得質(zhì)粒pMD18-TBvM14-GAI為模板，利用引物GAI-5-S、GAI-5-AS進(jìn)行BvM14-GAI基因的擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94℃4 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保存。利用In-Fusion技術(shù)將帶有BamHⅠ酶切位點(diǎn)的BvM14-GAI基因與酶切后的pCAMBIA1300載體進(jìn)行重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α菌株，提取質(zhì)粒測(cè)序。堿裂解法提取重組質(zhì)粒35S::pCAMBIA1300-BvM14-GAI，經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

1.2.2 擬南芥異源表達(dá)植株及異源互補(bǔ)植株的獲得 將BvM14-GAI序列在TAIR網(wǎng)站進(jìn)行同源性比對(duì)，選擇相似性最高且結(jié)構(gòu)域DELLA和GRAS保守的擬南芥GAI基因突變株(AT1G71200)并購(gòu)買。將購(gòu)買的擬南芥突變株種子種植在1/2MS培養(yǎng)基上，待出芽后移入土壤（草炭土:蛭石=1:1）中培養(yǎng)，待擬南芥突變株長(zhǎng)出3～5對(duì)葉片時(shí)提取基因組總DNA作為模板，利用突變株檢測(cè)引物GAI LP、GAI RP和LBA 1，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選獲得純合突變植株。反應(yīng)條件：94℃4 min；94℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保存。

利用花序浸染法將BvM14-GAI基因轉(zhuǎn)化擬南芥野生型植株(WT)和GAI基因突變株(KO)，成熟后收取種子在含30 mg/L Hyg的1/2MS固體培養(yǎng)基上篩選，獲得幼苗轉(zhuǎn)移至土壤（草炭土:蛭石=1:1）培養(yǎng)至成苗。對(duì)轉(zhuǎn)化后的擬南芥植株進(jìn)行基因組PCR和RT-PCR的檢測(cè)，篩選確定陽(yáng)性擬南芥植株。提取轉(zhuǎn)化植株基因組DNA為模板，利用基因特異引物GAI-5-S和GAI-5-AS進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件94℃ 4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 7 min；4℃保存。

采用RNA提取試劑盒提取轉(zhuǎn)化植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，以反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈為模板，GAI-6-S和GAI-6-AS為引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，利用18S rRNA基因作為內(nèi)參基因，反應(yīng)條件：94℃4 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 90 s，30 個(gè)循環(huán) ；72℃ 7 min；4℃保存。直至獲得T3代BvM14-GAI擬南芥異源表達(dá)和異源互補(bǔ)植株純合株系。

1.2.3 T3代陽(yáng)性擬南芥異源表達(dá)植株和異源互補(bǔ)植株的表型觀察及測(cè)定 分別將野生型擬南芥(WT)、GAI基因突變株(KO)、BvM14-GAI基因異源表達(dá)植株(OX)和BvM14-GAI基因異源互補(bǔ)植株(CO)4種植株種子種植在1/2MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，轉(zhuǎn)移至含有150 mmol/L NaCl的1/2MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)14天，進(jìn)行表型觀察，以0 mmol/L NaCl處理為對(duì)照，并測(cè)定植株根長(zhǎng)、鮮重和干重，每次測(cè)定進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2.4 K+、Na+和甜菜堿含量測(cè)定 將1.2.3中0 mmol/L NaCl處理下的4種植株(WT、KO、OX、CO)轉(zhuǎn)移至土壤（草炭土:蛭石=1:1）長(zhǎng)日照（16 h光/8 h暗）下正常培養(yǎng)，待植株生長(zhǎng)至4～6對(duì)葉片時(shí)，用150 mmol/L NaCl溶液澆灌脅迫處理，每天處理1次，共3次。取處理前后的擬南芥葉片進(jìn)行K+、Na+含量測(cè)定，每次測(cè)定進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，計(jì)算K+/Na+比。

取處理前后的擬南芥葉片烘干后過(guò)60目篩的樣品約0.02 g，加1 mL 80%甲醇溶液，置于60℃提取30 min，不斷震蕩，然后12000 r/min，25℃離心15 min，取上清液進(jìn)行甜菜堿含量測(cè)定，每次測(cè)定進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)，測(cè)定方法參考蘇州格銳思生物科技有限公司的甜菜堿(betaine)含量試劑盒說(shuō)明書。

1.2.5 SOD、POD含量測(cè)定 取1.2.4中150 mmol/L NaCl脅迫前后擬南芥植株葉片，測(cè)定SOD、POD含量，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。測(cè)定方法參考蘇州格銳思生物科技有限公司的超氧化物歧化酶(SOD)-WST法-分光法-96樣說(shuō)明書、過(guò)氧化物酶(POD)-WST法-分光法-96樣說(shuō)明書。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖，用GraphPad Prime 6軟件進(jìn)行方差分析，差異顯著性閾值為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建pCAMBIA1300-BvM14-GAI植物表達(dá)載體及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

根據(jù)1.2.1方法，隨機(jī)選取5個(gè)重組陽(yáng)性菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證，結(jié)果如圖1所示，均擴(kuò)增出與目的基因大小一致的條帶。提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示pCAMBIA1300-BvM14-GAI表達(dá)載體構(gòu)建成功，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105用于浸染擬南芥。

圖1 35S::pCAMBIA1300-BvM14-GAI重組質(zhì)粒特異引物PCR產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2 T3代BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)植株及異源互補(bǔ)植株的獲得

隨機(jī)選取12株擬南芥GAI基因突變株提取基因組DNA，并利用TAIR網(wǎng)站提供的突變株檢測(cè)引物對(duì)擬南芥GAI基因突變株進(jìn)行三引物PCR鑒定，結(jié)果圖2所示，以野生型為對(duì)照，編號(hào)1、2、3、4、7、8、10、11的8個(gè)株系為擬南芥GAI基因突變株純合系，選取擬南芥GAI基因突變株純合系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 擬南芥GAI基因突變株純合子篩選PCR篩選結(jié)果

參照1.2.2中的方法，對(duì)于浸染后獲得的擬南芥異源表達(dá)和異源互補(bǔ)植株，成熟后收取種子在含30 mg/L Hyg的1/2MS固體培養(yǎng)基上篩選（圖3），獲得幼苗轉(zhuǎn)移至土壤（草炭土:蛭石=1:1）培養(yǎng)至成苗，采用抗生素Hyg抗性篩選聯(lián)合基因組PCR及RT-PCR檢測(cè)T3代擬南芥植株。T3代擬南芥植株基因組PCR檢測(cè)如圖4所示，均含有目的條帶，說(shuō)明BvM14-GAI基因已成功轉(zhuǎn)入擬南芥野生型和GAI基因突變株。RT-PCR轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)如圖5所示，參比WT和KO植株，OX和CO植株中均能檢測(cè)到BvM14-GAI基因條帶，說(shuō)明該基因成功轉(zhuǎn)錄。獲得的T3代BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)植株(OX)和BvM14-GAI基因異源互補(bǔ)植株(CO)純合系，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 BvM14-GAI基因異源表達(dá)及異源互補(bǔ)陽(yáng)性擬南芥植株的抗性篩選(Hyg 30 mg/L)結(jié)果

圖4 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)植株及異源互補(bǔ)植株的PCR檢測(cè)結(jié)果

圖5 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)植株及異源互補(bǔ)植株的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)植株及異源互補(bǔ)植株鹽脅迫前后的表型觀察及測(cè)定

按1.2.3的方法對(duì)植株進(jìn)行觀察及根長(zhǎng)、鮮重、干重的測(cè)定，結(jié)果如圖6～7所示，0 mmol/L NaCl處理時(shí)，以WT、KO植株為對(duì)照，OX與CO植株根長(zhǎng)顯著短于對(duì)照，表明BvM14-GAI基因?qū)ιL(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用，為生長(zhǎng)負(fù)調(diào)控因子。150 mmol/L NaCl處理后，OX與CO植株根長(zhǎng)、鮮重、干重與對(duì)照組的差異均不顯著。

圖6 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)及異源互補(bǔ)植株鹽脅迫前后的表型及根長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果

圖7 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)及異源互補(bǔ)植株鹽脅迫前后的鮮重、干重測(cè)定結(jié)果

2.4 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)植株及異源互補(bǔ)植株鹽脅迫前后K+、Na+及甜菜堿含量的測(cè)定

由圖8A和8B可知，以WT和KO植株作為對(duì)照，OX與CO植株在150 mmol/L NaCl脅迫后K+/Na+與對(duì)照的差異均不顯著，維持了K+、Na+穩(wěn)態(tài)。由圖8C和8D可知，OX與CO植株150 mmol/L NaCl脅迫前后甜菜堿含量差異不顯著，但脅迫后甜菜堿含量比對(duì)照組略高。說(shuō)明BvM14-GAI基因的轉(zhuǎn)入能夠維持K+、Na+穩(wěn)態(tài)，增加甜菜堿含量，改善植株的滲透調(diào)節(jié)能力，從而提高BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)植株及異源互補(bǔ)植株的耐鹽性。

圖8 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)及異源互補(bǔ)植株鹽脅迫前后K+/Na+及甜菜堿含量測(cè)定結(jié)果

2.5 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)植株及異源互補(bǔ)植株鹽脅迫前后SOD、POD活性

由圖9A和9C可知，150 mmol/L NaCl脅迫后OX植株SOD活性和POD活性均顯著高于WT；CO植株SOD活性和POD活性變化與OX植株表現(xiàn)相同趨勢(shì)（圖9B和9D）。說(shuō)明BvM14-GAI基因的轉(zhuǎn)入增強(qiáng)了活性氧的清除能力，減少了NaCl帶來(lái)的氧化損傷，從而提高異源表達(dá)植株及異源互補(bǔ)植株的耐鹽性。

圖9 BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)及異源互補(bǔ)植株鹽脅迫前后SOD、POD活性測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論

筆者構(gòu)建了BvM14-GAI基因的植物表達(dá)載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥野生型和GAI基因突變株，通過(guò)對(duì)150 mmol/L NaCl脅迫下擬南芥異源表達(dá)和異源互補(bǔ)植株的表型和生理生化水平檢測(cè)分析，說(shuō)明BvM14-GAI可以提高擬南芥異源表達(dá)植株及異源互補(bǔ)植株的耐鹽性。本研究結(jié)果對(duì)BvM14-GAI基因的生物學(xué)功能研究進(jìn)行了有效補(bǔ)充，加深了甜菜M14品系耐鹽分子機(jī)理的研究，也為下一步甜菜耐鹽遺傳育種提供參考。

4 討論

GAI蛋白屬于GRAS家族中的DELLA亞家族，目前GAI基因序列已經(jīng)在多種植物中克隆，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、光信號(hào)傳導(dǎo)通路、激素信號(hào)通路和對(duì)逆境響應(yīng)的生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[14]，但甜菜中GAI基因功能研究尚未開展。Patrick等[15]曾發(fā)現(xiàn)鹽脅迫處理擬南芥DELLA四缺突變體(GAI、RGA、RGL1、RGL2)與擬南芥野生型時(shí)，DELLA四缺突變體的存活率顯著低于野生型；也有研究表明，擬南芥DELLA蛋白含量多時(shí)，植物耐鹽性增強(qiáng)[16]。DELLA蛋白作為赤霉素(GA)調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)過(guò)程的負(fù)反饋蛋白，對(duì)大豆的生長(zhǎng)發(fā)育以及開花起阻遏作用，同時(shí)DELLA蛋白也參與擬南芥幼苗的光形態(tài)建成[17-18]。本研究以擬南芥野生型植株(WT)和GAI基因突變株(KO)作為對(duì)照，0 mmol/L NaCl處理時(shí)，BvM14-GAI基因異源表達(dá)擬南芥植株(OX)根長(zhǎng)顯著短于WT植株，異源互補(bǔ)擬南芥植株(CO)的根長(zhǎng)也出現(xiàn)相同的表型，同樣影響了擬南芥幼苗形態(tài)建成，苗期生長(zhǎng)趨勢(shì)緩慢，因而DELLA的過(guò)量積累會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)[19]；150 mmol/L NaCl處理后，相比WT和KO植株，OX、CO植株的根長(zhǎng)與對(duì)照差異不顯著，因而DELLA蛋白的增加確實(shí)提高了擬南芥植株的耐鹽性。前期BvM14-GAI基因結(jié)構(gòu)分析表明，甜菜M14品系中的GAI基因具有GRAS和DELLA 2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，屬于GRAS家族中的DELLA亞家族，因而表現(xiàn)出相似的生物學(xué)功能[7]。

一般情況下，植物受到鹽脅迫時(shí)，主要是Na+過(guò)量累積造成離子毒害，Na+含量不斷增加導(dǎo)致K+含量呈下降趨勢(shì)，因而K+/Na+是衡量植物受到鹽脅迫損傷程度的重要指標(biāo)之一，維持適宜的K+/Na+比是緩解植物鹽脅迫的關(guān)鍵所在[20]。本研究中150 mmol NaCl脅迫處理后，BvM14-GAI基因的異源表達(dá)維持了擬南芥細(xì)胞內(nèi)K+、Na+穩(wěn)態(tài)，增強(qiáng)了異源表達(dá)和異源互補(bǔ)擬南芥植株的耐鹽性。甜菜堿是保護(hù)植物免受非生物脅迫，如鹽[21-23]、干旱[24-25]、冷[26-27]、高溫[28-29]等最通用的滲透保護(hù)劑之一。相比WT和KO植株，150 mmol/L NaCl脅迫處理后OX和CO植株的甜菜堿含量均表現(xiàn)為增加，表明BvM14-GAI基因的轉(zhuǎn)入使擬南芥植株的滲透調(diào)節(jié)能力得到了改善，從而提高BvM14-GAI基因擬南芥異源表達(dá)植株及異源互補(bǔ)植株的耐鹽性。

當(dāng)植物暴露于不利環(huán)境（如高鹽、干旱、高溫或寒冷）中時(shí)，通常以O(shè)2-和H2O2形式存在的ROS可以在植物中快速生成，過(guò)量的ROS會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞成分（如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和核酸）的氧化損傷[30]。較高的ROS水平也干擾蛋白質(zhì)合成和細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞和組織損傷。本研究中BvM14-GAI基因的異源表達(dá)均增加了SOD和POD酶的活性說(shuō)明BvM14-GAI基因可能通過(guò)提高抗氧化酶系統(tǒng)和調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)，增強(qiáng)擬南芥異源表達(dá)及異源互補(bǔ)植株對(duì)ROS的清除能力和離子穩(wěn)態(tài)平衡，提高擬南芥異源表達(dá)及異源互補(bǔ)植株的耐鹽能力。