郭國業(yè)，周 悅

(南陽師范學院 生命科學與農(nóng)業(yè)工程學院，河南省艾草開發(fā)利用工程技術研究中心，河南 南陽 473061)

0 引言

蒿屬(ArtemisiaLinn.)是菊科(Asteraceae)春黃菊族菊亞族的一個大屬，該屬植物在亞歐大陸集中分布.我國有187種46變種[1]，分布全國.在華北、西北、西南等地多生長在草場、荒漠、森林、戈壁以及高山草場，在華東、華中、華南地區(qū)的蒿屬植物多生長于荒野、道路旁以及海灘與叢林.蒿屬植物的開花期在8～9月份，常有濃郁的揮發(fā)性香氣；多為草本，少數(shù)為灌木、半灌木.有許多種類是重要或常用的藥草植物，可以當作利尿劑、化痰劑、抗炎癥藥、止血劑、低血壓藥、抗過敏藥或艾灸用藥，少數(shù)種供食用.有的植物根系粗大，耐鹽堿，莖和枝耐沙，可以作為抗御風沙的先鋒植物或者輔助植物[2].河南蒿屬植物資源較為豐富，常見的有艾(Artemisiaargyi)、黃花蒿(Artemisiaannua)、青蒿(Artemisiacarvifolia)、茵陳蒿(Artemisiacapillaris)、秦嶺蒿(Artemisiaqinlingensis)、蒙古蒿(Artenmisiamongolica)、南毛蒿(Artemisiachingii)等，多分布于山地、河坡、濕地、樹下、荒野及城區(qū)綠化地帶.

DNA條形碼(DNA barcoding)于2003年首次提出[3]，多用于物種的快速識別鑒定和系統(tǒng)進化研究等方面.目前，DNA條形碼技術在生命科學領域已經(jīng)成熟并得以廣泛應用，是物種譜系地理學研究和資源識別的重要工具[4].與傳統(tǒng)的形態(tài)分類學相比，DNA條形碼具有更加高效、準確的物種識別效率[5]，特別是在中藥資源鑒定、藥材流通體系等方面應用廣泛[6-9].近年來，DNA條形碼序列分析廣泛應用于植物的分類鑒定和系統(tǒng)親緣關系的分析，成為探索種質(zhì)關系的有效手段.目前，菊科中的已有多個屬種植物利用DNA條形碼基因來探究屬內(nèi)種間關系，但在蒿屬植物中的應用研究相對較少.蒿屬植物的系統(tǒng)分類學研究主要集中在形態(tài)分類上，在分子水平上的研究很少，急需通過分子鑒定以明確蒿屬植物的分類關系.

本研究利用DNA條形碼基因，對在南陽市白河濕地及其周邊區(qū)域分布的9個野生蒿屬植物的基因組進行序列變異分析、遺傳距離計算、構建NJ系統(tǒng)進化樹，旨在探究和分析蒿屬植物的種間親緣關系，以期為艾草植物的遺傳育種和開發(fā)利用提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為2020年10月，于河南南陽市區(qū)白河濕地公園及其周邊區(qū)域所采集的野生蒿屬植物的新鮮幼嫩葉片，并制成簡易標本保存.植物標本依據(jù)《中國植物志》進行形態(tài)學特征識別，并由中國科學院植物研究所高天剛研究員和南陽師范學院生命科學與農(nóng)業(yè)工程學院李景照教授識別鑒定，材料確定為黃花蒿(Artemisiaannua)、南毛蒿(Artemisiachingii)、野艾蒿(Artemisialavandulifolia)、蒙古蒿(Artemisiamongolica)、艾(Artemisiaargyi)，所有試驗材料均為野生種(表1).

表1 蒿屬植物種質(zhì)資源信息

1.2 植物基因組DNA的提取

對9個蒿屬植物樣品進行植物基因組DNA提取.分別稱取200 mg新鮮采集的植物葉片組織，液氮研磨.利用植物基因組DNA提取試劑盒進行基因組DNA提取[10].使用1.0 %的瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統(tǒng)(美國-BIO)檢測和成像.對樣品基因組檢測質(zhì)量不佳或顯示無帶的樣本重新提取，將提取的蒿屬植物基因組DNA 保存于-20 ℃.

1.3 引物篩選

實驗所用引物由華大基因公司(BGI)合成.利用變異速率較高且通用性強的19對候選 DNA 條形碼基因?qū)飳僦参顳NA進行PCR預擴增和篩選[11].以Tranks 2K分子 Maker為對照，利用候選條形碼基因?qū)Σ糠州飳僦参锏臉悠凡牧螪NA進行PCR擴增.將PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測和成像，成功獲得目的基因的單一克隆.最終篩選出 ITS2和psbA-trnH作為本實驗蒿屬植物的條形碼鑒定基因(表2).

表2 ITS2、psbA-trnH引物序列

1.4 PCR擴增、檢測及測序

通過對PCR反應體系和條件的優(yōu)化，確定最適反應體系及擴增程序，分別見表3和表4.基于所確定的最適PCR反應體系和擴增程序，利用ITS2和psbA-trnH基因?qū)λ杉?份蒿屬植物樣本進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物通過凝膠電泳檢測，利用凝膠成像系統(tǒng)成像，對單一克隆產(chǎn)物測序.

表3 PCR反應的最佳體系

表4 PCR反應程序

1.5 數(shù)據(jù)分析

將測序得到的條形碼基因序列在NCBI基因數(shù)據(jù)庫中進行Blast以驗證獲取序列的正確和準確度.利用MEGA基因分析軟件分別對trnH序列、ITS序列以及聯(lián)合基因序列進行變異位點、簡約信息位點、核苷酸置換率和遺傳距離等的分析，采用 NJ 鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建系統(tǒng)進化樹[12-13].

2 結果分析

2.1 DNA提取及PCR擴增

利用植物基因組試劑盒成功提取出9種蒿屬植物葉片的基因組DNA.基于ITS2和psbA-trnH基因引物均成功擴增出所有的植物材料的DNA片段，擴增產(chǎn)物大小為450 bp左右的單一明亮條帶，且擴增和測序的成功率均為100%.圖1為基于psbA-trnH和ITS2條形碼基因的蒿屬植物PCR 擴增凝膠電泳檢測結果.

圖1 基于psbA-trnH和ITS2條形碼基因的蒿屬植物PCR擴增檢測圖

2.2 ITS2和psbA-trnH基因序列變異分析

將測得的9條ITS2序列和psbA-trnH序列進行校正和比對分析，剪切兩端不可信序列，最終獲得ITS2序列總長為445 bp，psbA-trnH基因序列大小為441 bp.基因變異分析結果顯示，ITS2基因序列具有419個保守位點，19個變異位點，11個分離位點；psbA-trnH基因序列具有435個保守位點，6個變異位點，6個分離位點.

2.3 基于ITS2+psbA-trnH聯(lián)合基因的序列變異分析

基于psbA-trnH+ ITS2聯(lián)合基因的序列變異分析結果顯示(表5).聯(lián)合基因共有886個位點，缺失位點有19個，共有保守位點845個，多態(tài)位點22個，可變位點15個，簡約信息位點7個.聯(lián)合基因核苷酸多態(tài)性π為 0.008，顯示ITS2和psbA-trnH的聯(lián)合基因在蒿屬植物資源中具有較高的進化速率；基于ITS2與psbA-trnH的聯(lián)合基因的Tajima’D中性檢驗為-0.702，顯示種群基因變異偏離中性突變，在群體進化中可能遭遇了選擇壓力.分析數(shù)據(jù)顯示，將ITS2條形碼基因與psbA-trnH基因進行聯(lián)合數(shù)據(jù)分析表現(xiàn)出較高的序列核苷酸多樣性.

表5 psbA-trnH+ITS2聯(lián)合基因序列變異

2.4 基于ITS2+psbA-trnH聯(lián)合基因的系統(tǒng)進化分析

基于ITS2和psbA-trnH兩個基因的聯(lián)合分析具有更高的變異，適于系統(tǒng)進化樹重建.圖2為基于ITS2基因和psbA-trnH兩個基因的聯(lián)合并采用NJ鄰接算法重建蒿屬植物的系統(tǒng)進化樹.結果顯示，9個蒿屬植物重建的系統(tǒng)進化樹形成三個明顯的進化分支(圖2).分支Ⅰ包含艾、南毛蒿、野艾蒿和蒙古蒿，其中艾與野艾蒿同屬一個分支，野艾蒿與南毛蒿同屬一個分支，蒙古蒿與野艾蒿聚類，表明艾、野艾蒿和蒙古蒿植物具有較近的進化親緣關系.分支Ⅱ為1個南毛蒿植物單獨聚類，南毛蒿屬于蒿屬植物腺毛蒿組的多花蒿系，顯示該組植物與艾組植物的進化關系較遠，進化過程較為獨立.分支Ⅲ為1個艾蒿組(Sect.Abrotanum)黃花蒿系的黃花蒿植物，顯示該組植物與艾組植物在進化關系上存在明顯的遺傳分歧.

圖2 基于 ITS2+psbA-trnH聯(lián)合基因的蒿屬植物系統(tǒng)進化樹注：分支前的數(shù)字為自然支持值，分支后的數(shù)字為實驗材料編號

3 討論

DNA條形碼技術在植物學系統(tǒng)進化研究中起著重要作用.它以 DNA 序列為檢測對象，樣本選擇不受時節(jié)和環(huán)境的限制，有效擴大了樣本的選擇范圍[14].本實驗結果表明，不同的蒿屬植物具有較豐富的遺傳多樣性.依據(jù)《中國植物志》的系統(tǒng)地位劃分，艾、野艾蒿、蒙古蒿都屬于蒿屬植物中的艾組.其中，艾屬于艾組中的真艾系，蒙古蒿屬于艾組的艾系，野艾蒿屬于艾組的野艾蒿系，三種都同屬艾組，在系統(tǒng)進化樹上能夠準確聚為一個大分支，顯示三者親緣關系較近，與形態(tài)學分類地位一致.南毛蒿屬于蒿屬植物腺毛蒿組的多花蒿系，在《中國植物志》第76(2)卷中記錄了在河南南部有南毛蒿植物的分布，但在《河南植物志》(第3冊)里并未給予明確報道，李春鳳等通過調(diào)查采集及整理鑒定河南菊科蒿屬植物標本，對《河南植物志》蒿屬植物的南毛蒿進行了增補修訂和形態(tài)介紹[15-17].在本研究中，系統(tǒng)進化樹的分支Ⅰ中一個南毛蒿植物與艾組植物聚類，而5號南毛蒿植物則形成單獨聚類分支Ⅱ，顯示南毛蒿植物所在的腺毛蒿組植物與艾組植物存在一定的遺傳距離，后續(xù)將結合微形態(tài)學特征鑒定、細胞染色體分析和分子系統(tǒng)學方法，綜合分析基于分子進化樹所產(chǎn)生的兩組蒿屬植物的系統(tǒng)關系是否能夠表明在進化過程中發(fā)生了種間雜交和基因交流.依據(jù)中國植物志的系統(tǒng)分類地位，黃花蒿植物屬于艾蒿組的黃花蒿系，本研究的系統(tǒng)進化樹中顯示，黃花蒿植物單獨聚類在最外分支，顯示與其他蒿屬植物間存在明顯的遺傳分歧，進一步驗證了黃花蒿與其他艾組植物如艾、野艾蒿和蒙古蒿的親緣關系較遠.

本研究基于ITS2、psbA-trnH條形碼基因的聯(lián)合數(shù)據(jù)分析可以有效地實現(xiàn)對蒿屬植物進化親緣關系的分析.目前，蒿屬植物部分物種的分類地位和關系依舊存在爭議，本研究結論可以為鑒定蒿屬植物的種間親緣關系和分類提供一定的參考依據(jù)，對于開發(fā)蒿屬植物鑒定的DNA條形碼基因具有一定的參考意義.