張惠賢，崔文文，王明銳，姚晶晶，杜金平，孫 靜，張 昊

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，a.農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.畜牧獸醫(yī)研究所，武漢430064）

皮蛋，又稱松花蛋、變蛋、彩蛋等，是中國(guó)傳統(tǒng)風(fēng)味蛋制品之一，具有營(yíng)養(yǎng)豐富、色澤美觀、風(fēng)味獨(dú)特、食用方便等優(yōu)點(diǎn)［1，2］。在皮蛋腌制過(guò)程中，為了調(diào)控氫氧化鈉進(jìn)入量，需要在腌制液中添加一些重金屬鹽以達(dá)到“堵孔”的目的，控制皮蛋的品質(zhì)［3］。傳統(tǒng)的皮蛋加工工藝一般使用氧化鉛［4］，但是鉛會(huì)對(duì)人體健康造成危害，尤其會(huì)危害兒童的智力發(fā)育［5］。近年來(lái)，銅、鐵、鋅等重金屬被用來(lái)代替鉛［6，7］，“銅法”是實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用最普遍的皮蛋生產(chǎn)無(wú)鉛化技術(shù)［8］。

銅是人體所必需元素之一，但是由于中國(guó)人群的特殊膳食結(jié)構(gòu)，普遍不缺銅，皮蛋中過(guò)量的銅可能會(huì)導(dǎo)致“銅中毒”現(xiàn)象［9］，因此需要實(shí)時(shí)監(jiān)控生產(chǎn)過(guò)程中腌制液中銅離子濃度，防止皮蛋中銅含量過(guò)多。皮蛋腌制液的配料主要組成為氫氧化鈉、氧化鈣、重金屬鹽、茶葉等［7］，基質(zhì)成分復(fù)雜，鹽度和堿度高，對(duì)腌制液中Cu（Ⅱ）的快速、實(shí)時(shí)檢測(cè)非常困難，目前還未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）檢測(cè)的方法。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道了多種食品和環(huán)境中Cu（Ⅱ）的檢測(cè)方法，如分光光度法［10］、電化學(xué)分析法［11］、原子吸收光譜法［12］、電感耦合等離子體法［13］、電感耦合等離子體質(zhì)譜法等［14］。其中，原子吸收光譜法、電感耦合等離子體法和電感耦合等離子體質(zhì)譜法前處理繁瑣耗時(shí)、儀器昂貴，不適合Cu（Ⅱ）的快速檢測(cè)；電化學(xué)分析法不適合基質(zhì)復(fù)雜體系［15］。相比于其他方法，分光光度法具有成本低、快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，被廣泛用于廢水、食品、礦物等樣品中的Cu（Ⅱ）的檢測(cè)［16-19］。顯色試劑雙環(huán)己酮草酰二腙（BCO）可以與Cu（Ⅱ）發(fā)生顯色反應(yīng)生成穩(wěn)定的藍(lán)色絡(luò)合物Cu（BCO）2［19］。因此，本研究以BCO為絡(luò)合試劑，運(yùn)用分光光度法檢測(cè)皮蛋腌制液中的Cu（Ⅱ），實(shí)現(xiàn)復(fù)雜基質(zhì)、高鹽體系中高含量Cu（Ⅱ）的快速測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器DU800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Backman公司）；ME104型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；PHS-3C型酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.1.2 試劑雙環(huán)己酮草酰二腙（BCO）、硫酸銅、氨水、氯化銨、鹽酸、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、曲拉通X-100、十二烷基磺酸鈉（SDS）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和乙醇等試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用水為去離子水。

BCO（DMF/乙醇=v/v∶1/1）溶液（6.0 g/L）的配制：稱取0.3 g（精確至0.000 1 g）BCO，加入DMF/乙醇（v/v∶1/1）溶液加熱溶解，冷卻至室溫后，定容至50 mL。

Cu（Ⅱ）儲(chǔ)備液（0.8 g/L）的配制：根據(jù)皮蛋腌制過(guò)程中使用硫酸銅的量，稱取0.3 g（精確至0.000 1 g）五水硫酸銅，利用不含硫酸銅的皮蛋腌制液溶解，定容至100 mL。

Cu（Ⅱ）工作溶液配置（16 mg/L）：準(zhǔn)確移取儲(chǔ)備液1.00 mL，緩沖溶液定容至50 mL。

硼酸-硼砂、檸檬酸-氨水、硼酸-氫氧化鈉、氯化銨-氨水緩沖溶液在酸度計(jì)上混合至所需pH。

1.2 腌制液中銅離子絡(luò)合方法

由于皮蛋腌制液成分復(fù)雜，Cu（Ⅱ）可能會(huì)發(fā)生復(fù)雜的絡(luò)合反應(yīng)，在加入絡(luò)合試劑BCO前，加入鹽酸破壞Cu（Ⅱ）的基底絡(luò)合態(tài)，釋放出Cu（Ⅱ）。準(zhǔn)確移取2.0 mL皮蛋腌制液，加入2.0 mL 5.0 mol/L HCl溶液，振蕩均勻，放置20 min后，利用pH 9.0氯化銨-氨水緩沖溶液定容至100 mL。于25 mL比色管中，依次加入2.0 mL 6.0 g/L BCO儲(chǔ)備液、3.0 mL皮蛋腌制液稀釋液，用pH 9.0氯化銨-氨水緩沖溶液定容至25 mL后，渦旋搖勻，于30℃絡(luò)合反應(yīng)40 min。

1.3 皮蛋腌制液中硫酸銅含量的測(cè)定

移取顯色溶液于1 cm比色皿中，以相應(yīng)的參比溶液為參比，于分光光度計(jì)606 nm處測(cè)量吸光度，從校準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的Cu（Ⅱ）的含量，按式（1）計(jì)算硫酸銅的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

式中，M(CuSO4)為皮蛋腌制液中硫酸銅的濃度，g/L；m為從校準(zhǔn)曲線上查得的樣品顯色液中的Cu（Ⅱ）濃度，mg/L。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

25 mL比色管中分別加入2 mL的6.0 g/L BCO溶液，加入不同量的Cu（Ⅱ）標(biāo)準(zhǔn)溶液，氯化銨-氨水緩沖溶液定容至25 mL，使其濃度分別為0、0.32、0.64、1.28、1.92和2.56 mg/L，反應(yīng)完畢后分別測(cè)定其吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸收波長(zhǎng)的選擇

將絡(luò)合物Cu（BCO）2及空白皮蛋腌制液的吸收波長(zhǎng)進(jìn)行掃描，結(jié)果如圖1所示。絡(luò)合物Cu（BCO）2的最大吸收波長(zhǎng)在606 nm處（a），皮蛋腌制液（b）和BCO（c）溶液基本無(wú)吸收。結(jié)果表明，BCO檢測(cè)皮蛋腌制液中的銅離子具有可行性，選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為606 nm，樣品基質(zhì)及BCO在此波長(zhǎng)下無(wú)干擾。

圖1 絡(luò)合物Cu（BCO）2（a）、皮蛋腌制液（b）和BCO（c）的吸收波長(zhǎng)

2.2 絡(luò)合反應(yīng)條件研究

2.2.1 緩沖體系及pH的選擇選取硼酸-硼砂、檸檬酸-氨水、硼酸-氫氧化鈉和氯化銨-氨水4種緩沖體系，根據(jù)緩沖溶液的緩沖范圍選取pH。如圖2A所示，絡(luò)合反應(yīng)在硼酸-硼砂和硼酸-氫氧化鈉緩沖體系受pH影響較大，而在氯化銨-氨水緩沖體系的pH 8.0~10.0吸光度穩(wěn)定，在檸檬酸-氨水緩沖體系的pH 9.0~10.0吸光度穩(wěn)定，但吸光度低于氯化銨-氨水緩沖體系。故選擇氯化銨-氨水緩沖體系，絡(luò)合物Cu（BCO）2在pH 8.0~10.0吸光度是穩(wěn)定的，為減少pH變化帶來(lái)的影響，選擇pH 9.0的氯化銨-氨水緩沖體系。

2.2.2 緩沖鹽用量分別考察了pH 9.0的氯化銨-氨水緩沖溶液（0.2 mol/L氯化銨-1.0 mol/L氨水）不同用量對(duì)BCO絡(luò)合Cu（Ⅱ）的影響，結(jié)果如圖2B所示。緩沖溶液用量對(duì)絡(luò)合反應(yīng)無(wú)明顯影響，說(shuō)明在該pH下，絡(luò)合物Cu（BCO）2較為穩(wěn)定，為減少皮蛋腌制液對(duì)反應(yīng)溶液pH的影響，采用pH 9.0的氯化銨-氨水緩沖溶液定容。

圖2 不同緩沖體系及pH（A）及緩沖鹽用量（B）對(duì)BCO絡(luò)合Cu（Ⅱ）的影響

2.2.3 反應(yīng)溫度與反應(yīng)時(shí)間絡(luò)合反應(yīng)的效率與時(shí)間和溫度密切相關(guān)，圖3A是反應(yīng)溫度和時(shí)間對(duì)BCO絡(luò)合Cu（Ⅱ）的影響，結(jié)果表明，反應(yīng)溫度為30℃時(shí)，在40 min時(shí)吸光度最大，同時(shí)反應(yīng)時(shí)間80 min時(shí)，吸光度僅下降了7.4%，表明絡(luò)合物Cu（BCO）2在該溫度下較為穩(wěn)定。故選擇反應(yīng)溫度為30℃，反應(yīng)時(shí)間為40 min。

2.2.4 BCO用量影響根據(jù)實(shí)際皮蛋腌制液硫酸銅使用的最大濃度3.0 g/L，設(shè)置Cu（Ⅱ）濃度為1.2 mg/L，加入不同量的BCO 6.0 g/L（DMF/乙醇=1/1）溶液，使其濃度分別為0.048、0.096、0.144、0.192、0.240、0.300 g/L，考察BCO用量對(duì)顯色的影響。結(jié)果（圖3B）表明，當(dāng)BCO的用量是Cu（Ⅱ）40倍以上時(shí)，其用量對(duì)顯色反應(yīng)基本無(wú)影響，故選擇BCO用量為0.048 g/L。

圖3 反應(yīng)時(shí)間和溫度（A，a：30℃；b：40℃；c：50℃）和BCO用量（B）對(duì)BCO絡(luò)合Cu（Ⅱ）的影響

2.2.5 離子掩蔽劑的影響鐵離子、鋁離子等元素會(huì)干擾Cu（Ⅱ）的測(cè)定，選擇加入檸檬酸三銨掩蔽鐵離子、鋁離子等離子的干擾，考察了檸檬酸三銨對(duì)絡(luò)合反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，由于皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于干擾離子濃度，因此離子掩蔽劑對(duì)絡(luò)合反應(yīng)影響不大。

2.3 體系穩(wěn)定性

顯色劑及其絡(luò)合物的穩(wěn)定性對(duì)樣品檢測(cè)非常重要，考察了Cu（BCO）2絡(luò)合物在150 min內(nèi)的穩(wěn)定性。如圖4所示，絡(luò)合物在室溫150 min內(nèi)基本穩(wěn)定，150 min時(shí)吸光度只下降約3.0%，對(duì)檢測(cè)無(wú)影響，滿足檢測(cè)要求。

圖4 室溫下絡(luò)合物Cu（BCO）2的穩(wěn)定性

2.4 工作曲線、回收率及精密度

在最佳絡(luò)合條件下，考察了該方法的線性范圍、檢測(cè)限和重現(xiàn)性。吸光度與Cu（Ⅱ）的濃度在0~2.56 mg/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.067 71x-0.011 57，其中，y為吸光度，x為Cu（Ⅱ）的濃度（mg/L），相關(guān)系數(shù)R2為0.999 5。

分別在不含Cu（Ⅱ）離子的皮蛋腌制液中添加硫酸銅，使其Cu（Ⅱ）最終濃度分別為0.12、0.24、0.48、0.72 g/L，按照最優(yōu)的絡(luò)合反應(yīng)條件進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)計(jì)算加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）的加標(biāo)回收率在97.9%~103.4%，日內(nèi)、日間標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）低于3.17%，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度和精密度。

表1 皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）的添加回收率和日內(nèi)日間精密度（n=5）

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

抽取皮蛋加工廠的不同時(shí)期的皮蛋腌制液，根據(jù)優(yōu)化好絡(luò)合反應(yīng)條件測(cè)得其中Cu（Ⅱ）的含量，再根據(jù)式（1）計(jì)算其中硫酸銅的含量分別為2.78、1.23、2.07和1.01 g/L。

3 結(jié)論

本研究首次將雙環(huán)己酮草酰二腙（BCO）用于分光光度測(cè)定皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ），BCO與Cu（Ⅱ）的絡(luò)合物Cu（BCO）2最大收波長(zhǎng)為606 nm，BCO及皮蛋腌制液在此波長(zhǎng)下無(wú)吸收，極大地降低了來(lái)自皮蛋腌制液基底的背景干擾，使樣品前處理更為簡(jiǎn)單。建立的皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）檢測(cè)方法具有方便、快速、直接、靈敏、省時(shí)和抗干擾能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。最后，將該方法用于皮蛋腌制液硫酸銅含量的準(zhǔn)確測(cè)定，為皮蛋生產(chǎn)過(guò)程中硫酸銅含量的監(jiān)測(cè)提供有力工具。