何 力，羅海濤，劉思奎，鄒恩凱，任周營，邵燈寅，陳俊宇，羅建飛

（1.江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，南昌330000；2.云南瑞升煙草技術(shù)（集團）有限公司，昆明650000）

烏梅，別名酸梅、黑莓，薔薇科植物梅的果實。烏梅喜溫暖濕潤、陽光充足的環(huán)境，耐寒、耐旱、不耐澇。據(jù)相關(guān)研究表明烏梅中含有蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、谷甾醇、維生素和礦物質(zhì)等多種成分［1，2］。烏梅被廣泛用于食品、藥品以及化工行業(yè)，是一種極具開發(fā)潛力的水果［3，4］。利用烏梅原料制作傳統(tǒng)香料的工藝已經(jīng)很成熟，但是利用微生物進行烏梅原料發(fā)酵的研究還鮮有報道。微生物發(fā)酵方法不論從香味獨特性、成本控制、競爭力以及危廢處理上，都展現(xiàn)出了廣闊的市場前景［5］。傳統(tǒng)提取工藝無法將烏梅原料中纖維素、果膠等物質(zhì)進行利用，而微生物的代謝活動能充分利用這些物質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)化成其他物質(zhì)［6-8］，本研究利用從松樹林土壤中篩選出的一株真菌進行烏梅原料的發(fā)酵試驗，并對其致香成分進行分析，為微生物發(fā)酵香料研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

HP6890/5973 GC/MS分析儀，美國Agilent公司；SHZ-LII予華牌循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；LABOROA 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，Heido?lph；PL3002電子精密天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SW-CJ-1D單人凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；DW-86L388J醫(yī)用低溫保存箱，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司。

1.2 材料與試劑

烏梅原料（自制）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖水，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；LB培養(yǎng)基，青島海博生物科技有限公司；TSA培養(yǎng)基，青島海博生物科技有限公司；丙三醇AR，西隴化工股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選從云南昆明當(dāng)?shù)厮蓸淞种胁杉x地表10 cm深處的土壤10 g［9］，放入已滅菌的蒸餾水中，搖床搖晃1 h±10 min，使土壤中自然存在的菌種充分脫落，然后利用滅菌紗布過濾土壤，之后取其搖晃充分的液體進行稀釋涂布平板法接種，接種結(jié)束后，PDA平板放于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5~7 d，TSA平板放于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24~48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察長有單菌落的平板，將不同菌落形態(tài)的單菌落挑入液體培養(yǎng)基中，PDA平板的單菌落挑入馬鈴薯糖水培養(yǎng)基中培養(yǎng)3~5 d，TSA平板的菌落挑入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24~48 h，無單菌落平板不進行菌種挑選，培養(yǎng)結(jié)束后，進行平板劃線純化菌株，之后保種于-80℃低溫冰箱中。從土壤中篩選出真菌3株，選用其培養(yǎng)液氣息較好的一株真菌進行發(fā)酵試驗，該真菌在PDA平板上蔓延性生長，能清晰地看見菌絲體，呈青色，表面附著有孢子，在培養(yǎng)3 d后開始出現(xiàn)肉眼可見的菌體，5 d后形成孢子。將其孢子接種進馬鈴薯糖水進行搖床培養(yǎng)，24 h后培養(yǎng)基可變渾濁，48~72 h后可在培養(yǎng)基中形成菌絲球［10］。

1.3.2 菌株分子生物學(xué)鑒定方法將獲得的菌液，經(jīng)過液氮冷凍后，取2 g放入研缽中進行研磨，研成粉末狀后加入DNA提取液（0.2 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、0.01 mol/L EDTA、1%SDS），添加比例為每0.1 g粉末加入2 mL提取液，然后加入與提取液等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液（體積比為25∶24∶1），于渦旋器上劇烈渦旋5 min，然后置于冷凍離心機內(nèi)以8 000 r/min、4℃離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到一個新離心管中，向該離心管中加入300 mL的無水乙醇置于-20℃放置30 min。之后取出離心管，以10 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清液，在空氣中放置10 min使乙醇揮發(fā)完全。加入2 mL的TE溶液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA）溶解沉淀即得到基因組DNA。之后將提取獲得的DNA進行PCR擴增，引物對為ITS1，然后將得到的PCR產(chǎn)物進行切膠純化后進行測序獲得其結(jié)果。

1.3.3 正交試驗設(shè)計利用Penicillium polonicum真菌進行烏梅原料發(fā)酵的單因素設(shè)計試驗，以及根據(jù)微生物發(fā)酵在其他底物上的應(yīng)用［11，12］，以發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和菌液接種量為主要影響因素，感官評吸分數(shù)作為考察指標，進行L9（34）正交試驗，每項試驗重復(fù)3次。

1.3.4 菌株發(fā)酵試驗種子液的制備：取出保存菌株，接種于馬鈴薯糖水培養(yǎng)基中，接種量為菌種保存液∶培養(yǎng)基=1∶100，接種后于搖床中28℃，180 r/min培養(yǎng)72 h后取出備用。

底物制備：取烏梅去核果肉100 g于錐形瓶中，補水至400 g后放入高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20 min，結(jié)束后拿出冷卻到常溫備用。

發(fā)酵濃縮試驗：在無菌環(huán)境下，取已制備好的種子液，接種于冷卻至常溫制備好的底物中，接種后充分搖晃后，放于搖床中培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后取出發(fā)酵液，裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進行濃縮，水浴溫度為70℃，烏梅發(fā)酵浸膏濃縮至密度為（1.390±0.008）g/cm3。

1.3.5 樣品致香成分檢測方法將制得的發(fā)酵烏梅浸膏與未發(fā)酵的烏梅原料，利用同時蒸餾萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測其致香成分并進行結(jié)果分析。

同時蒸餾萃取：取發(fā)酵樣品與未發(fā)酵原料各25 g放入同時蒸餾萃取裝置一端的500 mL圓底燒瓶中，加入250 g水，用電熱套加熱，裝置的另一端為盛有25 mL二氯甲烷的100 mL圓底燒瓶，用60℃水浴加熱，同時蒸餾萃取2 h。二氯甲烷萃取液用無水硫酸鈉干燥，置于4℃保藏柜放置，過濾，濾液倒入濃縮瓶中用Vigreux柱濃縮至約1 mL，濃縮液用于GC/MS分析備用。

GC/MS條件：毛細管柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度240℃；載氣He，1 mL/min；程序升溫50℃（1 min）→8℃/min→160℃（2 min）→8℃/min→260℃（15 min）；進樣量1 μL，分流比20∶1；傳輸線溫度280℃；電離方式EI，電離能量70 eV；離子源溫度230℃；四級桿溫度160℃；質(zhì)量范圍35~455 aum，溶劑延遲時間2 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株鑒定結(jié)果

根據(jù)堿基對分析得到以下結(jié)果，見圖1。通過測序結(jié)果對比查詢可知，該菌株為Penicillium polon?icum真菌，有相關(guān)研究表明該真菌的代謝產(chǎn)物在各領(lǐng)域中有較多的應(yīng)用［13-15］。且劉靜等［15］在利用其PDB培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后，得到了酯類、烯烴類、醛類以及雜環(huán)類物質(zhì)。

2.2 工藝優(yōu)化

經(jīng)前期單因素試驗驗證，將發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度以及接種量作為主要影響因素，制作正交因素水平表L9（34）（表1），利用SPSS軟件進行正交試驗設(shè)計對發(fā)酵工藝進行優(yōu)化。

表1 正交試驗因素水平表L9（34）

2.2.1 正交試驗結(jié)果直觀分析根據(jù)正交設(shè)計直觀結(jié)果（表2）和極差值R的結(jié)果（表3）可以得出，各因素對感官評吸分數(shù)影響大小的順序為發(fā)酵時間（A）＞發(fā)酵溫度（B）＞接種量（C）。

表2 正交試驗結(jié)果

表3 各因素水平均值與極差

根據(jù)3因素的平均值以及水平均值（圖2）分析可以得出，發(fā)酵溫度為25℃，感官評吸分數(shù)最高；發(fā)酵時間為24 h，感官評吸分數(shù)最高；接種量為2%，感官評吸分數(shù)最高。因此得出其最佳的組合方式為A1B1C2，即發(fā)酵烏梅原料的條件為溫度25℃、發(fā)酵24 h、接種量2%。

圖2 三因素三水平均值

2.2.2 正交試驗結(jié)果的方差分析和多重比較方差分析結(jié)果（表4）表明，各因素對發(fā)酵烏梅原料的感官評吸結(jié)果的影響為發(fā)酵時間影響顯著（P＜0.05），發(fā)酵溫度影響顯著（P＜0.05），接種量影響不顯著（P＞0.05）。

表4 L9（34）正交試驗方差分析

多重因素比較結(jié)果（表5至表7）表明，發(fā)酵時間中24、48 h水平之間差異不顯著（P＞0.05），發(fā)酵溫度中25、30℃之間差異不顯著（P＞0.05），接種量各水平之間差異不顯著（P＞0.05），因此，可以確定其最適合發(fā)酵條件為A1B1C2，即發(fā)酵時間24 h，發(fā)酵溫度25℃，接種量2%。

表5 因素A多重比較（LSD法）

表7 因素C多重比較（LSD法）

2.3 致香成分分析

利用正交試驗所得結(jié)果進行發(fā)酵后烏梅提取物與未發(fā)酵烏梅原料的致香成分進行分析，利用同時蒸餾萃取-氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法得到以下致香成分，結(jié)果見表8。

表6 因素B多重比較（LSD法）

發(fā)酵烏梅提取物與未發(fā)酵烏梅原料致香成分分析可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵烏梅浸膏中在應(yīng)用方面有正面作用的苯甲醇、苯乙醇、苯乙醛［16，17］的含量明顯增加，并且產(chǎn)生了新的揮發(fā)性物質(zhì)，其中3-戊烯-2-酮、己醛、乙酸丁酯、2-甲基丁酸、乙酰乙酸乙酯都帶有果香味，可以豐富烏梅發(fā)酵浸膏果類香味。此外，發(fā)酵后的浸膏中具有抑制香氣作用的戊酸、己酸、苯甲酸、癸酸乙酯［18］的含量下降。

由表8可知，發(fā)酵的烏梅原料中酸類有12種，醛類5種，酯類24種，酮類13種，醇類6種，酚類4種，烯烴類1種，雜環(huán)類11種，共76種物質(zhì)，其主要為糠醛（94.192 μg/g）、苯甲酸（34.948 μg/g）、棕櫚酸（155.395 μg/g）、棕櫚酸乙酯（69.033 μg/g）、亞油酸（38.596 μg/g）、亞油酸乙酯（54.879 μg/g）、亞麻酸乙酯（35.929 μg/g）。發(fā)酵24 h烏梅提取物中酸類有8種，醛類8種，酯類23種，酮類16種，醇類2種，酚類4種，烯烴類1種，雜環(huán)類7種，共68種致香物質(zhì)，有9種新增物質(zhì)，發(fā)酵提取物揮發(fā)性成分主要為苯甲醇（34.035 μg/g）、苯甲酸（30.113 μg/g）、棕櫚酸（111.236 μg/g）、棕櫚酸乙酯（38.695 μg/g）、亞油酸（34.555 μg/g）、亞油酸乙酯（32.446 μg/g）。發(fā)酵48 h烏梅提取物中酸類有8種，醛類8種，酯類22種，酮類17種，醇類2種，酚類5種，烯烴類1種，雜環(huán)類7種，共70種，有11種新增物質(zhì)，發(fā)酵提取物揮發(fā)性成分為苯甲醇（33.397 μg/g）、棕櫚酸（76.872 μg/g）、棕櫚酸乙酯（31.954 μg/g）。

表8 未發(fā)酵烏梅浸膏與發(fā)酵烏梅浸膏致香成分

續(xù)表

從圖3和圖4分析可得，發(fā)酵24h烏梅提取物與未發(fā)酵烏梅原料相比，致香物質(zhì)中糠醛含量下降79.03%，戊酸下降100%，己酸下降86.21%，正己酸己酯下降100%，苯甲酸下降13.83%，松油醇下降100%，十五酸下降27.70%，棕櫚酸乙酯下降43.95%，亞油酸下降10.47%，亞油酸乙酯下降40.88%，亞麻酸乙酯下降34.21%；而也有一些含量明顯增加的物質(zhì)，如3-甲基丁醛上升37.94%，苯甲醇上升89.99%，苯乙醛上升102.19%，4-烯丙基苯酚上升80%，二氫獼猴桃內(nèi)酯上升35.77%。發(fā)酵48 h烏梅提取物與未發(fā)酵烏梅原料相比，糠醛含量下降79.47%，戊酸下降100%，己酸下降84.60%，正己酸己酯下降100%，苯甲酸下降45.85%，松油醇下降100%，十五酸下降28.04%，棕櫚酸乙酯下降53.71%，亞油酸下降49.57%，亞油酸乙酯下降52.47%，亞麻酸乙酯下降48.88%；而也有一些含量明顯增加的物質(zhì)，如3-甲基丁醛上升45.23%，苯甲醇上升86.43%，苯乙醛上升109.72%，4-烯丙基苯酚上升51.72%，二氫獼猴桃內(nèi)酯上升14.04%。綜上，利用Penicillium polonicum真菌進行烏梅原料發(fā)酵，能提高致香物質(zhì)中果香類物質(zhì)的含量，降低抑制香氣物質(zhì)的含量。在發(fā)酵過程中部分致香物質(zhì)發(fā)酵24 h后含量上升，但發(fā)酵48 h后，開始下降，這是因為微生物代謝活動所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的過多積累會影響菌株的生長，當(dāng)代謝產(chǎn)物積累到一定量時，菌株代謝活動將被抑制，甚至?xí)么x產(chǎn)物重新合成其他的物質(zhì)［19］。

圖3 致香成分分析

圖4 致香成分分析

3 結(jié)論

本試驗利用從松樹林土壤中篩選出來的Peni?cillium polonicum真菌菌株，在烏梅原料上進行發(fā)酵，發(fā)酵后物質(zhì)含量和數(shù)量有明顯改變，苯甲醇、苯乙醛和3-甲基丁醛的含量有明顯的上升，并且新增了己醛、2-甲基丁酸、異麥芽酚等物質(zhì)，它們都能為浸膏帶來強烈的果香味。從數(shù)據(jù)上可以推論Peni?

cillium polonicum真菌主要是利用浸膏中的糠醛和有機酸類物質(zhì)進行自身的代謝活動，而產(chǎn)生其他的醇類、酚類、醛類與雜環(huán)類物質(zhì)，由于雜環(huán)類物質(zhì)有不飽和的閉環(huán)體系，因此性質(zhì)穩(wěn)定，且與苯系物有著相似的性質(zhì)［20，21］，醇、酚、醛以及苯系物大部分具有豐富香氣的作用，對發(fā)酵的烏梅提取物的致香成分積累有著重要的作用。而且從發(fā)酵時間上來看，發(fā)酵24 h的提取物積累的致香物質(zhì)總量相對較多，發(fā)酵后的樣品能帶來更好的清甜香氣，說明該菌株以烏梅為原料進行發(fā)酵時，發(fā)酵24 h時效果達到最佳。