張立蘋，華再東，肖紅衛(wèi)，任紅艷，朱 喆，畢延震

（湖北省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室，武漢430064）

精原干細胞（spermatogonial stem cells，SSCs）是一類位于雄性哺乳動物睪丸生精小管基膜上、具有自我更新與定向分化能力并能夠產生精母細胞的成體干細胞，也是雄性動物體內惟一能夠將自身遺傳物質傳遞給下一代的干細胞，是生成精子的基礎細胞［1］。因此，通過SSCs的體外培養(yǎng)和細胞移植，可為繁育優(yōu)良動物個體、生產基因修飾動物、治療雄性不育和人類某些遺傳疾病提供新思路和新方法［2］。而通過對哺乳動物精原干細胞的誘導分化得到的功能性精子，是解決人類生殖問題的安全、有效的途徑，且對精子發(fā)生過程、精原干細胞自我更新與分化、生產基因修飾動物等方面的研究具有重要的科學研究意義［3］。

SSCs的體外分離、細胞純化和鑒定是開展其生物學特性研究、誘導分化及在基因編輯動物制備和種質資源保存上應用的關鍵和首要步驟，優(yōu)化精原干細胞分離純化技術和鑒定方法，建立高效、便捷的精原干細胞體外培養(yǎng)體系，有助于精原干細胞生物學特性和增殖分化機制的進一步研究以及精原干細胞在基因編輯動物制備方面的應用［4］。Kanatsu-Shinohara等［5］首次成功將小鼠精原干細胞誘導為多潛能干細胞。近年來，隨著小鼠精原干細胞體外分離培養(yǎng)技術的不斷改進，基本能富集到大量細胞，促進了SSCs誘導多能干細胞和體外誘導精子的研究。大動物的SSCs體外分離技術也逐漸興起，但尚未完全成熟［6，7］。

本試驗通過對比不同日齡湖北白豬睪丸精原干細胞的體外分離培養(yǎng)及初步鑒定結果，建立適用于湖北白豬精原干細胞體外分離培養(yǎng)體系，從而為進一步在體外培養(yǎng)條件下研究湖北白豬精原干細胞的分化能力、自我更新能力等提供有力條件，并為后續(xù)制備基因編輯豬提供原材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物隨機選取5日齡、10日齡、15日齡健康湖北白豬，由湖北省瘦肉豬研究中心提供。

1.1.2 主要試劑DMEM-F12培養(yǎng)液、胎牛血清、雙抗（1 000 IU/mL）、DPBS等試劑購自于GIBCO公司；Ⅳ型膠原蛋白酶、0.25%胰蛋白酶購自于Sigma公司；DNaseⅠ購自于Invitrogen公司；BCIP/NBT堿性磷酸酶染色試劑盒購自于碧云天生物技術有限公司。

1.1.3 主要儀器Leica DMI3000B倒置顯微鏡，Ep?pendorf AG 22331 Hamburg離心機。

1.2 方法

1.2.1 湖北白豬精原干細胞分離采集5日齡、10日齡、15日齡湖北白豬睪丸，選擇75%乙醇溶液擦拭湖北白豬手術部位，活體采集湖北白豬睪丸，75%乙醇溶液洗滌2 min，35℃生理鹽水（含雙抗100 U/mL）洗滌3次后保溫帶回實驗室；將取回的睪丸放入裝有生理鹽水（含雙抗100 U/mL）的平皿中，用鑷子將睪丸提起，用剪刀將睪丸外部組織等剝離，清洗后放在另一個培養(yǎng)皿中，剝去睪丸膜，換入下一個培養(yǎng)皿將睪丸剪碎，分為3份，分別轉入2、4、8 mg/mL 3種濃度Ⅳ型膠原蛋白酶中37℃水浴鍋消化30 min，600 r/min離心3 min去除大部分的睪丸間質細胞，收集曲細精管于50 mL離心管中并置于37℃水浴鍋，加入0.25%胰蛋白酶中消化分離精原干細胞，消化期間鏡檢觀察精原干細胞的分離情況，當消化為單細胞時，加入培養(yǎng)液終止消化，40 μm網(wǎng)篩過濾，分裝到2 mL離心管中，1 000 r/min離心5 min洗滌2遍，重懸后接種到6孔板中，每管一孔，補加培養(yǎng)液至2 mL進行培養(yǎng)。在39℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，24 h半量換液。

1.2.2 湖北白豬精原干細胞純化采用差異貼壁法純化湖北白豬精原干細胞。將接種在6孔板中細胞放在39℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，移液器輕輕吹打，吸取上清液，并接種到新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。重復此操作3~4次貼壁，收集未貼壁的細胞置飼養(yǎng)層培養(yǎng)。

1.2.3 湖北白豬精原干細胞體外培養(yǎng)取胎牛血清10 mL加入600 μL雙抗，加入DMEM-F12至60 mL，即為精原干細胞體外培養(yǎng)液。將最后一次貼壁板上的細胞消化傳代至飼養(yǎng)層細胞上，按2 mL/孔加入六孔板，39℃、5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)，24 h半量換液。培養(yǎng)基中添加不同濃度（10、20、30、40和50 ng/mL）LIF，分析LIF對湖北白豬精原干細胞體外培養(yǎng)的影響。

1.2.4 飼養(yǎng)層細胞的處理當2次貼壁的六孔板中貼壁細胞匯合度達到70%~80%時，DPBS洗滌2遍，加入0.5 mL 0.25%胰蛋白酶消化2~3 min，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞消化情況，當細胞邊緣處于微微皺縮時，加入1 mL培養(yǎng)基終止消化并傳代，傳代細胞量為400 μL/孔。傳代細胞匯合度達到90%時加入20 μg/mL絲裂霉素C處理2 h，即得飼養(yǎng)層細胞。

1.2.5 湖北白豬精原干細胞堿性磷酸酶檢測棄去培養(yǎng)在六孔板中干細胞的舊培養(yǎng)基，用提前在37℃保溫箱中預熱的DPBS洗滌2次，4%多聚甲醛固定10~15 min，DPBS洗滌3次，每孔加入1 mL BCIP/NBT染色工作液，室溫避光孵育5~30 min，棄BCIP/NBT染色工作液，DPBS清洗終止顯色反應，在熒光倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 湖北白豬精原干細胞的分離純化

選取5日齡、10日齡、15日齡湖北白豬睪丸（圖1A）進行平行試驗。結果表明，10日齡小豬睪丸更適合分離精原干細胞，5日齡小豬睪丸小且嫩，試驗前為防止出現(xiàn)細胞污染現(xiàn)象，需要75%乙醇溶液對湖北白豬睪丸進行消毒，消毒的同時對睪丸也產生一定的損傷，分離得到的細胞生長緩慢且狀態(tài)不佳，15日齡豬睪丸分離獲取的細胞生長時間長。

在利用Ⅳ型膠原蛋白酶消化時，對比濃度2、4、8 mg/mLⅣ型膠原蛋白酶消化睪丸組織情況。結果表明，4 mg/mLⅣ型膠原蛋白酶水浴消化睪丸組織30 min獲取曲細精管（圖1B），聯(lián)合0.25%胰蛋白酶消化獲取精原干細胞效果最好（圖1C精原干細胞與支持細胞等混合液），組合酶的聯(lián)合使用既便于鏡檢細胞的消化程度，又減少了細胞損傷；同時試驗對DNaseI的使用進行了對比，研究發(fā)現(xiàn)DNaseI對分離干細胞的結果影響不顯著，但使用DNaseI時，液體的黏稠度降低，有利于過濾。

圖1 湖北白豬精原干細胞體外分離純化

2.2 湖北白豬精原干細胞的體外培養(yǎng)

采用差異貼壁分選方法純化湖北白豬精原干細胞。將接種在6孔板中的細胞放在37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，輕輕吹打，吸取上清液，接種到新的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，重復3~4次貼壁，收集未貼壁的細胞置飼養(yǎng)層培養(yǎng)。湖北白豬精原干細胞分離培養(yǎng)發(fā)育進程如圖2所示。從圖2可以看出，湖北白豬精原干細胞在體外培養(yǎng)過程中，細胞逐漸聚集形成細胞松散的細胞集落，最后形成緊密細胞簇，并且在體外培養(yǎng)過程中，細胞始終呈圓形狀態(tài)，且附著在支持細胞表面。而睪丸分離出來的支持細胞等貼壁細胞自培養(yǎng)12 h貼壁鋪展于培養(yǎng)皿底部，并且開始增殖。試驗對比了不同濃度（10、20、30、40和50 ng/mL）LIF對精原干細胞體外培養(yǎng)的影響，結果顯示影響不顯著。試驗同時對比了湖北白豬睪丸支持細胞在湖北白豬精原干細胞培養(yǎng)中的作用，結果發(fā)現(xiàn)湖北白豬睪丸支持細胞對湖北白豬精原干細胞的體外培養(yǎng)影響顯著，且20 μg/mL絲裂霉素C處理2 h的支持細胞效果更好，但是形態(tài)上絲裂霉素C處理前后的支持細胞沒有明顯區(qū)別（圖3）。

圖2 湖北白豬精原干細胞體外培養(yǎng)發(fā)育進程

圖3 絲裂霉素C處理前后的支持細胞

2.3 湖北白豬精原干細胞堿性磷酸酶鑒定

對培養(yǎng)的干細胞進行了堿性磷酸酶鑒定，結果如圖4所示。結果表明，用堿性磷酸酶進行細胞染色后，干細胞表現(xiàn)出較強的堿性磷酸酶活性，且顏色明顯，而支持細胞不著色。

圖4 湖北白豬精原干細胞堿性磷酸酶鑒定

3 小結與討論

3.1 湖北白豬精原干細胞的分離純化

動物精原干細胞體外分離純化培養(yǎng)是研究其生物學特性、誘導分化及在基因編輯動物制備和種質資源保存上應用的基礎［4］，而SSCs的分離是體外培養(yǎng)和細胞系能否成功構建的首要步驟。研究表明，動物精原干細胞具有較強的自我更新和分化能力，理論上可以在各年齡段雄性動物睪丸中分離得到，但獲得的干細胞比例隨動物年齡增加而明顯降低［8］。研究發(fā)現(xiàn)，SSCs在新生小鼠睪丸中可達到約1.41%，而在成年小鼠睪丸中則降低至0.02%~0.03%［9］，因此，取材動物年齡的選擇對SSCs的分離非常重要。研究者分離精原干細胞多選用青春期前的雄性動物睪丸作為原材料。本試驗分別對5日齡、10日齡和15日齡湖北白豬精原干細胞進行了體外分離純化培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)10日齡湖北白豬睪丸更適用于精原干細胞的體外分離培養(yǎng)。

目前，獲得動物睪丸組織的單細胞懸液一般都采用兩步酶消化法，該方法雖然得到不斷的改良和優(yōu)化，但基本的思路是相同的［10-13］，即先用消化能力緩和的膠原酶消化間質細胞，暴露內在的曲細精管，再用0.25%胰蛋白酶進一步消化其曲細精管后，用網(wǎng)篩過濾掉細胞壁等雜質，獲得單細胞懸液［14-18］。2007年，Goel等［19］在消化豬睪丸組織過程中，首先去掉了間質細胞，最后分離SSCs，從而提高了分離細胞的純度。Yang等［20］比較了豬精原干細胞分離方法，發(fā)現(xiàn)采用酶消化法與機械法結合的方式能獲得更高比率的活細胞，約為僅使用機械法獲取干細胞的10倍。本研究中采用機械分離法聯(lián)合酶消化獲取精原干細胞，即先用剪刀將已經(jīng)處理過的睪丸組織剪碎，用Ⅳ型膠原蛋白酶在37℃水浴30 min對組織塊進行消化，600 r/min離心3 min除去大部分的睪丸間質細胞，收集曲細精管，0.25%胰蛋白酶中消化分離精原干細胞，最后用40 μm網(wǎng)篩過濾收集得到SSCs細胞，其中對Ⅳ型膠原酶的濃度進行了對比試驗，表明4 mg/mL的膠原酶Ⅳ進行消化，消化時間30 min，效果最好，即便于鏡檢細胞的消化程度，又減少了細胞損傷；離心管處于水浴中進行消化，效果更好；研究發(fā)現(xiàn)DNaseI，對分離干細胞的效果影響不顯著，但是使用DNaseI時，液體的黏稠度降低，有利于過濾。

3.2 湖北白豬精原干細胞的體外培養(yǎng)

動物精原干細胞分離富集后的體外培養(yǎng)是成功建立SSCs細胞系的關鍵環(huán)節(jié)，只有SSCs可以在體外傳代并長期培養(yǎng)，才能得到足夠的細胞量，從而為后續(xù)細胞的生物學研究提供足夠的試驗原材料，適當?shù)腟SCs培養(yǎng)條件可使動物精原干細胞完成自身損傷的修復和增殖，為細胞的遺傳修飾及準備受體動物爭取時間，提高細胞移植和基因編輯效率［21］。然而，動物精原干細胞的體外培養(yǎng)效果主要取決于最佳培養(yǎng)條件的探索和選擇。

飼養(yǎng)層細胞即用物理或化學方法人為處理后不能再次增殖的細胞，但是細胞本身仍然能夠分泌諸多生長因子，從而促進精原干細胞增殖［22］或抑制細胞分化［23］，因而飼養(yǎng)層有助于干細胞建系［24］。目前，常用的飼養(yǎng)層細胞有睪丸支持細胞、BEF細胞和小鼠胚胎成纖維細胞耐鳥苯苷亞系（STO細胞）等。冉競超等［25］利用膠原酶和透明質酸酶混合使用來除去間質細胞，從而獲得較純的支持細胞作干細胞培養(yǎng)的飼養(yǎng)層，并在培養(yǎng)基中添加GDNF、LIF和bFGF等生長因子后，精原干細胞克隆明顯增加。Zhang等［26］分離新生仔豬的支持細胞作為干細胞的飼養(yǎng)層細胞，并在DMEM-F12添加10%血清替代物（knockout serum replacement，KSR）和4種細胞因子（GDNF、GFRα1、bFGF和IGF1）作為培養(yǎng)基，獲得未分化的豬精原細胞，且該細胞可以在體外增殖至少2個月而不喪失細胞干性。本試驗用湖北白豬精原干細胞體外分離純化時2次貼壁的支持細胞經(jīng)過20 μg/mL絲裂霉素C處理2 h后作為飼養(yǎng)層進行湖北白豬精原干細胞的體外培養(yǎng)得到了較好的效果，湖北白豬睪丸支持細胞跟精原干細胞同種來源，體外培養(yǎng)過程中經(jīng)過直接分泌或旁分泌產生的生長因子營造的細胞生長微環(huán)境更接近于精原干細胞體內生長環(huán)境，促進了湖北白豬精原干細胞的體外生長發(fā)育。

生長因子是細胞在分化和生長過程中必不可少的一類生物分子。研究表明，白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor，LIF）是胚胎干細胞（Embryo stem cell，ESCs）體外自我更新和促進增殖的關鍵細胞因子［27，28］。試驗表明，LIF對鼠睪丸生殖細胞的體外增殖有促進作用；Dirami等［29］研究表明在培養(yǎng)基中添加EGF、GDNF、LIF、bFGF和SCF 5個生長因子的單個或任意組合時均促進體外SSCs的增殖。在本試驗中添加LIF對湖北白豬精原干細胞的生長發(fā)育影響不顯著。

3.3 湖北白豬精原干細胞鑒定

動物精原干細胞的鑒定方法主要有形態(tài)學鑒定法、表面特異性標記鑒定法及功能性鑒定法等。本試驗主要通過形態(tài)學聯(lián)合堿性磷酸酶進行了湖北白豬精原干細胞的鑒定，體外培養(yǎng)72 h后干細胞形成集落，培養(yǎng)第6天形成結構緊密的干細胞簇，這與其他研究者的結果一致［11］。研究表明，結構和功能完整的SSCs中有完整的AKP表達，因此，利用AKP細胞化學反應對SSCs進行鑒定，本試驗利用AKP對體外培養(yǎng)的PSSCs進行了鑒定，表明細胞是湖北白豬SSCs并具有干細胞的基本特征。