劉 威，袁芳艷，周丹娜，劉澤文，高 婷，郭 銳，楊克禮，段正贏，梁 婉，田永祥

（湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)湖北科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，武漢430064）

羊流產(chǎn)嗜性衣原體（Chlamydia abortus）為專性細(xì)胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，是一種重要的人畜共患傳染病病原，屬于衣原體科（Chlamydiaceae）衣原體屬（Chlamydia），能引起豬、牛、羊等多種動物流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)弱仔等［1］。流產(chǎn)衣原體為世界動物衛(wèi)生組織（Office international desépizooties，OIE）規(guī)定的二類動物疾病，該病廣泛分布于世界各地［2］，對畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，孕婦感染也可發(fā)生流產(chǎn)［3］，其診斷和防治制劑的研究具有十分重要的公共衛(wèi)生及經(jīng)濟(jì)意義［4］。

流產(chǎn)衣原體主要寄生于牛、羊、豬等多種動物生殖道黏膜表面的上皮細(xì)胞內(nèi)［5］。不同年齡段的羊都可感染且臨床表現(xiàn)不同：新生羔羊主要以關(guān)節(jié)炎、腦炎癥狀為主；公羊主要以睪丸炎癥狀為主；母羊主要發(fā)生妊娠后期流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎等［6］。母羊在流產(chǎn)后會獲得免疫保護(hù)，但其仍成為衣原體的攜帶者，會在發(fā)情期將大量的原生小體（EB）排出體外，成為新的傳染源［7］。疫苗接種是預(yù)防衣原體感染的有效措施，然而由于雞胚生產(chǎn)疫苗的工藝復(fù)雜、耗時(shí)費(fèi)力、成本高等原因，中國市場上還沒有商品化的羊衣原體疫苗。臨床上一般采用抗生素治療該病，但容易產(chǎn)生耐藥性，引起持續(xù)、慢性、亞臨床感染［8］。長期使用抗生素對羊地方性流產(chǎn)（Ovine enzootic abor?tion，OEA）進(jìn)行防治并不是一個(gè)理想的方法，也不符合當(dāng)前“減抗限抗”的政策要求。利用現(xiàn)代生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)尋找羊流產(chǎn)嗜性衣原體新的藥物靶標(biāo)，將為OEA的防控、新型藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 基因組序列與數(shù)據(jù)庫

羊流產(chǎn)嗜性衣原體標(biāo)準(zhǔn)菌株S26/3的全基因組序列來源于NCBI數(shù)據(jù)庫，氨基酸序列通過Artemis導(dǎo)出。直系同源分析時(shí)涉及到的數(shù)據(jù)來源于Database of Interaction Protein（DIP）數(shù)據(jù)庫。

1.2 方法

1.2.1 同源蛋白映射DIP數(shù)據(jù)庫中蛋白與蛋白間的互作關(guān)系已經(jīng)通過酵母雙雜交、免疫共沉淀等方法證實(shí)。同源蛋白映射（HPM）是通過整合試驗(yàn)中已確定的蛋白-蛋白相互作用信息，來預(yù)測未知蛋白間的互作網(wǎng)絡(luò)［9］。圖1展示了同源蛋白映射的原理。例如DIP數(shù)據(jù)庫中C與D能發(fā)生互作，而蛋白A與C同源，B與D同源，那么A和B極可能發(fā)生相互作用。基于此通過HPM構(gòu)筑蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。

圖1 同源蛋白映射方法的原理

1.2.2 相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建DIP數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列從DIP網(wǎng)站上下載獲得。Blast軟件包和羊流產(chǎn)嗜性衣原體的基因組序列從NCBI FTP服務(wù)器下載［10］。利用Formatdb將羊流產(chǎn)嗜性衣原體的氨基酸序列建庫，DIP數(shù)據(jù)庫中的氨基酸序列與羊流產(chǎn)嗜性衣原體氨基酸序列的同源性通過Blastp確定（E-value 1e-30）。Blastp得到的初步比對結(jié)果通過Script程序映射成互作網(wǎng)絡(luò)，以獲得最終的牛支原體蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)通過可視化軟件Cytoscape［11］展示。

表1 本研究中涉及的軟件與數(shù)據(jù)庫

2 結(jié)果與分析

2.1 羊流產(chǎn)嗜性衣原體蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

通過同源蛋白映射的方法構(gòu)建羊流產(chǎn)嗜性衣原體蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。如圖2所示，預(yù)測的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中包含220個(gè)蛋白和1 276個(gè)相互作用關(guān)系，蛋白用圓形的節(jié)點(diǎn)表示，相互作用關(guān)系用藍(lán)色的直線表示。

圖2 羊流產(chǎn)嗜性衣原體蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.2 蛋白相互作用發(fā)生頻率的分析

在蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，互作頻率表示某單一蛋白與其他蛋白發(fā)生相互作用的數(shù)量?；プ黝l率較高的蛋白往往參與細(xì)胞的多種生命活動，在細(xì)胞的生存中起著十分關(guān)鍵的作用。表2列出了互作頻率最高的20個(gè)蛋白，大多數(shù)蛋白與轉(zhuǎn)錄、翻譯、分子伴侶等功能相關(guān)。CAB_RS01240、CAB_RS03155和CAB_RS01655分別編碼伴侶蛋白DnaK、GroEL和DnaJ，這幾個(gè)蛋白的互作頻率較高，且都能與核酸代謝蛋白（如UMP kinase等）、核糖體結(jié)構(gòu)相關(guān)蛋白（如CAB_RS00255等）、DNA復(fù)制與修復(fù)相關(guān)蛋白（如CAB_RS00140，CAB_RS02555等）、熱休克蛋白（如CAB_RS03085等）發(fā)生相互作用。若DnaK、Gro?EL和DnaJ的功能受到抑制，將嚴(yán)重影響羊流產(chǎn)衣原體的生存和繁殖，結(jié)果提示DnaK、GroEL和DnaJ可以作為新型藥物的潛在靶標(biāo)。

表2 相互作用網(wǎng)絡(luò)中互作頻率較高的20個(gè)蛋白

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中不同功能蛋白的分布

蛋白質(zhì)直系同源簇（COGs）數(shù)據(jù)庫是對細(xì)菌、藻類和真核生物的21個(gè)完整基因組的編碼蛋白，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分類構(gòu)建而成。COGs庫常用于未知蛋白的功能預(yù)測和蛋白功能的分類研究中。對羊流產(chǎn)嗜性衣原體蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中互作頻率高于10次的蛋白進(jìn)行了功能分布分析，首先將互作頻率高于10次的蛋白根據(jù)蛋白質(zhì)直系同源簇（COGs）數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能分類，隨后對不同COGs功能類別的蛋白個(gè)數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖3所示?；プ黝l率較高的功能蛋白主要與DNA復(fù)制、核糖體結(jié)構(gòu)、翻譯、分子伴侶和防衛(wèi)機(jī)制等功能相關(guān)。DnaK、DnaJ和GroEL均為HSP家族，與ClpB形成多分子伴侶系統(tǒng)。該系統(tǒng)可穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)凝聚、變性，并具有修復(fù)變性蛋白的能力，參與多種細(xì)胞進(jìn)程［12］。CAB_RS00140編碼DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶，拓?fù)洚悩?gòu)酶是生物體內(nèi)的基礎(chǔ)酶類，參與到所有涉及DNA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)變化的生命活動中，如DNA的復(fù)制，轉(zhuǎn)錄和重組。核糖體是細(xì)胞內(nèi)一種核糖核蛋白顆粒，由RNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其惟一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質(zhì)多肽鏈，是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成的分子機(jī)器。UMP/CMP激酶通過催化UMP、CMP和dCMP轉(zhuǎn)化為二磷酸形式，為核酸合成提供前體方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［13］。上述蛋白在維持細(xì)胞正常的生命活動中都起著十分關(guān)鍵的作用，若這些蛋白的功能受到抑制將嚴(yán)重影響羊流產(chǎn)嗜性衣原體的生存與繁殖。

圖3 羊流產(chǎn)嗜性衣原體蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中不同功能蛋白的分布

3 小結(jié)與討論

病原菌互作蛋白組學(xué)分析是解析致病相關(guān)信號通路和挖掘潛在藥物靶標(biāo)的重要工具［9］。本研究通過HPM的方法構(gòu)建了羊流產(chǎn)嗜性衣原體的蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，所構(gòu)建的互作網(wǎng)絡(luò)包括220個(gè)蛋白和1 276個(gè)相互作用關(guān)系。HPM方法主要通過同源蛋白映射證實(shí)的互作關(guān)系，推斷功能未知蛋白之間的互作。為了減少假陽性的發(fā)生，在構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)時(shí)，通過結(jié)合序列覆蓋率和E-value［14］值綜合評價(jià)單一蛋白和互作關(guān)系的準(zhǔn)確性，以確定最終的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。

在蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中，蛋白發(fā)生互作的頻率越高提示該蛋白在病原菌生命活動中越重要。在完成了牛支原體蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建后，通過COGs對互作頻率最高的20個(gè)蛋白進(jìn)行了功能分類。在這20個(gè)蛋白中，大多數(shù)蛋白與核糖體、DNA復(fù)制與修復(fù)、分子伴侶、轉(zhuǎn)錄與翻譯等功能相關(guān)。分子伴侶和核糖體蛋白往往在細(xì)胞的生命活動中起著關(guān)鍵的作用，例如伴侶蛋白能幫助蛋白正確折疊和降解，對細(xì)胞內(nèi)病原菌抵抗宿主細(xì)胞的環(huán)境壓力十分重要。在羊流產(chǎn)嗜性衣原體蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中，DnaK、DnaJ和GroEL發(fā)生互作的頻率較高，能與核糖體蛋白、DNA復(fù)制與修復(fù)、核酸代謝等多種蛋白發(fā)生相互作用。一旦DnaK、DnaJ和GroEL的功能受到抑制，將會對羊流產(chǎn)嗜性衣原體的正常生命活動造成不小的影響。

本研究通過HPM的方法構(gòu)建了羊流產(chǎn)嗜性衣原體蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建將為新型藥物靶標(biāo)的尋找、新的信號分子的篩選提供依據(jù)。