周垂楊 柯樂斌 高仁賢

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是臨床上常見的急危重癥，由多種炎性細(xì)胞因子和免疫細(xì)胞共同參與，以彌漫性肺泡損害導(dǎo)致嚴(yán)重低氧血癥為特征，ALI及其嚴(yán)重階段急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是胸外傷、大面積燒傷和嚴(yán)重感染性疾病的主要致死原因[1, 2]。目前，臨床上對ALI/ARDS的治療以對癥支持治療為主，尚缺乏有效的治療手段和特效藥，患者病死率仍高達(dá)30%～50%[3]。因此，探討ALI的發(fā)病機(jī)制，尋找一種新的治療策略是極其重要和緊迫的。急性肺損傷的發(fā)病機(jī)制是復(fù)雜的，包括中性粒細(xì)胞的募集、炎性細(xì)胞因子的釋放和上皮細(xì)胞的凋亡，這些因素導(dǎo)致了肺泡上皮屏障的破壞、肺水腫和氣體交換的異常[4]。在 ALI 的各種致病因素當(dāng)中，以內(nèi)毒素(主要成分是脂多糖 LPS)最為常見。

研究表明microRNA在調(diào)控ALI發(fā)生、發(fā)展方面具有重要意義[5]。已有研究發(fā)現(xiàn)，miR-146a高表達(dá)可明顯抑制 LPS 誘導(dǎo)的小鼠肺組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶 (iNOS)、炎性細(xì)胞因子TNF-α、白介素-6(IL-6)和IL-1β釋放[6]。microRNA-181b能夠調(diào)節(jié)NF-κB介導(dǎo)的血管炎癥，并且降低內(nèi)毒血癥性小鼠的肺損傷[7]。而miR-127則可下調(diào)FcγRI/CD64的表達(dá)，減少IgG IC誘導(dǎo)的小鼠過度肺部炎性反應(yīng)[8]。靶向特異性的miRNA可作為一種新型的分子標(biāo)志物，用于評估及監(jiān)測ALI的發(fā)生、發(fā)展，對改善ALI患者肺部功能和預(yù)后具有重要意義。

本研究通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究了miR-519d-3p對脂多糖LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡的影響及其具體作用機(jī)制，對探索新的ALI診療手段具有重要意義，一定程度上為ALI的分子治療靶點(diǎn)提供了新的研究策略。

材料與方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及其分組：人肺上皮細(xì)胞A549購自美國模式培養(yǎng)物保藏所。A549培養(yǎng)在含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，并在37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用脂多糖LPS處理A549模擬急性肺損傷體外細(xì)胞模型[9]。LPS溶解在二甲基亞砜(濃度<0.1%)中。分別用0、100、1000、104ng/ml的LPS處理A549細(xì)胞24h，摸索LPS后續(xù)處理濃度。NF-κB抑制劑 Bay 11-7082預(yù)處理濃度為5μmol/L，預(yù)處理時長為1h，之后撤掉抑制劑進(jìn)行后續(xù)處理。細(xì)胞分組按相應(yīng)實(shí)驗(yàn)要求分為：對照組(不做任何處理)、LPS處理組、LPS+miR-519d-3p激動劑組、LPS+miR-519d-3p拮抗劑組、LPS+Bay 11-7082組、LPS+Bay 11-7082+miR-519d-3p激動劑組。

2．細(xì)胞轉(zhuǎn)染：A549細(xì)胞于轉(zhuǎn)染前一天接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜后，用lipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。將miR-519d-3p拮抗劑或激動劑用opti-MEM(美國Gibco公司)稀釋，lipofectamineTM2000在另外離心管中稀釋后，兩者混合室溫靜止20min，緩慢滴加至鋪好細(xì)胞的培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)。于4h換液后繼續(xù)后續(xù)處理。

3.qRT-PCR檢測miR-519d-3p水平：使用TRIzol試劑盒(美國Thermo Scientific公司)提取A549細(xì)胞總的miRNA。然后使用Taqman MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)合成cDNA。運(yùn)用7900HT快速實(shí)時PCR系統(tǒng)(美國Applied Biosystems公司)進(jìn)行定量PCR檢測。使用2-△△CT法測定相對miRNA水平。內(nèi)參為U6。miR-519d-3p引物序列如下：正向引物5′-TGCGGCAAAGTGCCTCCCTTTAG-3′；反向引物5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

4.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡：使用 Annexin V-FITC/PI 染色試劑盒(美國BD Biosciences公司)檢測A549細(xì)胞的凋亡率。不同分組的A549細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)的處理后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個/毫升。使用結(jié)合緩沖液懸浮，10μl Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)添加到100μl細(xì)胞懸浮液中，室溫遮光孵育15min。使用流式細(xì)胞儀(美國BD Biosciences公司)檢測凋亡細(xì)胞。

5.Western blot法檢測蛋白表達(dá)：使用RIPA裂解緩沖液(美國Thermo Scientific公司)裂解各處理組A549細(xì)胞。再使用BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Scientific公司)測定了蛋白質(zhì)的濃度。用10%的SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜(NC膜)上。然后，使用5%脫脂奶粉封閉NC膜。緊接著，一抗Bax(#33-6400)、caspase-3(#PA5-114687)、Bcl-2(#13-8800)、TLR4(#48-2300)、p-IκBα(#2859)、IκBα(#4814)、p-p65(#MA5-15160)和p65(#51-0500)過夜孵育。次日，二抗孵育?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測蛋白條帶。p-IκBα和IκBα抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，其余抗體均購自美國Invitrogen公司。β-actin作為內(nèi)參。

6.細(xì)胞免疫熒光檢測 NF-κB p65蛋白細(xì)胞核移位：細(xì)胞按相應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件處理后，4%多聚甲醛室溫固定A549細(xì)胞，然后0.2% Triton X-100打孔，3% BSA封閉1h。加入一抗 (抗NF-κB，1∶100稀釋) 孵育2h。緊接著，二抗避光孵育1h。洗滌后加入DAPI染核，避光孵育30min。最后，使用熒光顯微鏡觀察拍照。

結(jié) 果

1.LPS上調(diào)A549的miR-519d-3p水平：LPS處理后的A549細(xì)胞內(nèi)miR-519d-3p水平上調(diào)，并呈濃度依賴性(圖1)。由于LPS濃度為104ng/ml時，miR-519d-3p水平與1000ng/ml比較，未顯著上調(diào)，因此本研究選擇LPS濃度為1000ng/ml，處理時間為24h構(gòu)建急性肺損傷體外細(xì)胞模型。

圖1 LPS處理A549細(xì)胞內(nèi)miR-519d-3p水平與0ng/ml比較，*P=0.000

2.miR-519d-3p促進(jìn)A549細(xì)胞凋亡：轉(zhuǎn)染miR-519d-3p激動劑，發(fā)現(xiàn)miR-519d-3p水平顯著上升；轉(zhuǎn)染miR-519d-3p拮抗劑，發(fā)現(xiàn)miR-519d-3p水平顯著下調(diào)(圖2A)。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，過表達(dá)miR-519d-3p使得細(xì)胞凋亡進(jìn)一步被促進(jìn)；下調(diào)miR-519d-3p表達(dá)，細(xì)胞凋亡被一定程度抑制(圖2B)。同時，Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)。LPS誘導(dǎo)后，Bax和cleaved caspase-3表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)；過表達(dá)miR-519d-3p使得Bax和cleaved caspase-3表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)；下調(diào)miR-519d-3p表達(dá)，Bax和cleaved caspase-3表達(dá)下調(diào)，Bcl-2表達(dá)上調(diào)(圖2C)。

圖2 miR-519d-3p對A549細(xì)胞凋亡的影響A.qRT-PCR檢測miR-519d-3p水平；B.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；C.Western blot法檢測Bax、cleaved caspase-3和Bcl-2蛋白表達(dá)水平

3.miR-519d-3p影響TLR4/NF-κB通路：LPS處理使得TLR4、p-IκBα和p-p65蛋白水平顯著上調(diào)。同時，上調(diào)miR-519d-3p水平，TLR4、p-IκBα和p-p65蛋白水平進(jìn)一步上調(diào)；下調(diào)miR-519d-3p水平，TLR4、p-IκBα和p-p65蛋白水平隨之下調(diào)(圖3A)。利用細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測NF-κB蛋白細(xì)胞核移位，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-519d-3p水平能夠明顯誘導(dǎo)NF-κB蛋白的細(xì)胞核移位，使得細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白水平顯著上升；下調(diào)miR-519d-3p水平，細(xì)胞核內(nèi)NF-κB蛋白水平下調(diào)(圖3B)。

圖3 miR-519d-3p對TLR4/NF-κB通路的影響(×200)A.Western blot法檢測TLR4、p-IκBα、IκBα、p-p65、p65蛋白表達(dá)水平；B.細(xì)胞免疫熒光檢測NF-κB蛋白細(xì)胞核移位

4.NF-κB抑制劑可緩解LPS導(dǎo)致的miR-519d-3p上調(diào)引起的A549細(xì)胞凋亡：NF-κB特異性抑制劑 Bay 11-7082處理后，miR-519d-3p水平(圖4A)和TLR4蛋白表達(dá)沒有顯著的改變，但p-IκBα和p-p65表達(dá)顯著下調(diào)(圖4B)，細(xì)胞凋亡水平顯著下降(圖4中C～D)；然后轉(zhuǎn)染miR-519d-3p激動劑后，miR-519d-3p水平和TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞凋亡水平也隨之升高。

圖4 NF-κB抑制劑Bay 11-7082對A549細(xì)胞凋亡的影響A.qRT-PCR檢測miR-519d-3p水平；B.Western blot法檢測TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平；C.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡；D.Western blot法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平

討 論

ALI主要以肺部炎癥和細(xì)胞凋亡為特征，是一種人類常見的臨床疾病，在ALI的發(fā)展中，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為與ALI的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[10]。肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的凋亡已被證明是導(dǎo)致ALI中上皮屏障功能損傷和某些間充質(zhì)細(xì)胞重塑的原因[11]。細(xì)胞凋亡途徑的失控激活會導(dǎo)致炎癥和肺組織的破壞，抑制細(xì)胞凋亡能夠治療ALI。同時，大量的研究已經(jīng)明確了miRNAs在ALI 的發(fā)生和發(fā)展中的重要作用。Fu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)miR-181a能夠通過靶向Bcl-2減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷。Tang等[13]研究報道，miR-126-5p在LPS誘導(dǎo)的ALI小鼠中也起了類似的作用靠下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)。Wu等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-326 靶向BCL2A1基因激活NF-κB信號通路，加重了ALI小鼠感染性休克的炎性反應(yīng)和肺損傷。

脂多糖(LPS)是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要生物活性成分，已被廣泛用于誘導(dǎo)ALI模型[15]。本研究利用LPS處理人肺上皮細(xì)胞A549模擬ALI細(xì)胞模型。LPS能夠上調(diào)A549細(xì)胞中的miR-519d-3p水平，并呈濃度依賴性。同時發(fā)現(xiàn)miR-519d-3p能夠促進(jìn)A549細(xì)胞的細(xì)胞凋亡。已有研究表明，miR-519d-3p 通過靶向HIF-2α能夠促進(jìn)缺氧條件下HeLa細(xì)胞凋亡，抑制增殖[16]。miR-519d-3p在喉部鱗狀細(xì)胞癌中也有同樣的作用[17]。但miR-519d-3p促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡具體作用機(jī)制還需進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，LPS處理能夠改變miR-519d-3p水平，進(jìn)而影響TLR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)。上調(diào)miR-519d-3p水平能夠激活TLR4/NF-κB通路。有研究表明，TLR4/NF-κB通路與細(xì)胞凋亡相關(guān)[18]。miR-519d-3p水平上調(diào)能夠促進(jìn)TLR4蛋白表達(dá)。TLR4是LPS最主要的受體[19]。LPS與TLR4蛋白結(jié)合，啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，然后導(dǎo)致NF-κB激活，引起核內(nèi)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因廣泛轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)大量凋亡相關(guān)蛋白生成，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生[20]。本研究應(yīng)用NF-κB特異性抑制劑 Bay 11-7082預(yù)處理A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡水平顯著下降，再轉(zhuǎn)染miR-519d-3p激動劑，LR4/NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，細(xì)胞凋亡水平也隨之升高。進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-519d-3p通過調(diào)控TLR4/NF-κB通路影響細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究探討了miR-519d-3p/TLR4/NF-κB通路對LPS誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制，為miR-519d-3p/TLR4/NF-κB通路作為ALI藥物靶點(diǎn)開發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，具有一定的轉(zhuǎn)化價值。但miR-519d-3p對于TLR4蛋白表達(dá)的具體調(diào)控作用機(jī)制需在后續(xù)進(jìn)行深入研究。