俞森權(quán) 胡佳麗 高文倉

肺癌在全球范圍內(nèi)是發(fā)生率和病死率最高的惡性腫瘤，并且近年來其發(fā)生率仍在不斷上升[1]。肺癌主要分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中后者占大多數(shù)[2]。據(jù)統(tǒng)計很多患者在晚期階段才被確診，因此錯過了疾病的最佳治療時間[3]。盡管現(xiàn)有的治療方法多樣，但非小細胞肺癌患者的預(yù)后較差，生存率仍較低，5年生存率為30%左右[4]。因此，尋找有效的藥物和治療手段對降低非小細胞肺癌病死率，提高預(yù)后生存率至關(guān)重要。

中醫(yī)藥防治腫瘤有數(shù)千年歷史，能夠在干預(yù)癌前病變、預(yù)防轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)、帶瘤生存等方面發(fā)揮重要作用[5, 6]。已有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者若能夠配合正規(guī)的中醫(yī)藥進行穩(wěn)定長期治療，生活質(zhì)量和存活時間得到顯著改善[7]。中藥能夠通過多種機制抗腫瘤，如抑制腫瘤細胞增殖，促進凋亡，逆轉(zhuǎn)藥物耐藥等[8]。

苦參堿是中草藥苦參活性成分的提取物質(zhì)，為四環(huán)噻嗪啶類化合物，屬于生物堿類物質(zhì)[9]。有研究證明苦參素在多種癌癥治療中發(fā)揮作用，如肝癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌等[10～12]?？鄥A能夠促進抗腫瘤免疫反應(yīng)、誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡和自噬、抑制腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移、逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞耐藥性等[13]。本研究探討了苦參堿在非小細胞肺癌中對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移侵襲的影響及其分子機制，為非小細胞肺癌的中藥治療及其相關(guān)研究提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

材料與方法

1.人肺癌細胞培養(yǎng)：從中國科學(xué)院購入人肺癌細胞株A549和H1650(上海生命科學(xué)研究院細胞庫)。使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基(美國賽默飛世爾科技公司)按照常規(guī)方法培養(yǎng)細胞，隔天換液，長滿時進行傳代。取處于對數(shù)生長期的A549和H1650細胞進行實驗。

2.非小細胞肺癌小鼠模型構(gòu)建:本實驗所用BALB/c裸鼠來自杭州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。本實驗操作通過浙江省實驗動物中心實驗動物福利倫理學(xué)委員會審核(倫理學(xué)審批號：ZJCLA-IACUC-20020019)。首先制備了濃度為1×106個/毫升的A549單細胞懸液，皮下注射于裸鼠右側(cè)腋下，飼養(yǎng)10天。待造模成功后，隨機分為對照組和實驗組，每組6只。實驗組小鼠將苦參堿溶液按75mg/kg進行連續(xù)腹腔注射2周。對照組小鼠注射10ml/kg 0.9%氯化鈉注射液。小鼠處死后，剝離腫塊，測量體積及重量并采集圖片。每次測量重復(fù)3次以上。

3.MTT比色法:將A549和H1650接種至96孔板中，使用不同濃度(0.5、1.0、2.0mg/ml)苦參堿進行孵育。MTT法檢測細胞活力改變，每孔添加5mg/ml MTT溶液(美國賽默飛世爾科技公司)20μl，繼續(xù)孵育4h后去上清液。使用酶聯(lián)免疫檢測儀于490nm處檢測吸光度(A)值。

4.AnnexinV/PI染色:1.0mg/ml苦參堿處理A549和H1650后，收集細胞。先后加入Annexin V-FITC和PI(美國賽默飛世爾科技公司)進行避光孵育，流式細胞儀檢測凋亡細胞。

5.劃痕實驗：待A549和H1650細胞密度飽和，垂直平板劃痕，PBS洗滌脫落的細胞。加入1.0mg/ml苦參堿培養(yǎng)48h后，倒置顯微鏡下觀察并計算細胞遷移距離。

6.Transwell實驗：在涂有Matrigel膠的Transwell小室上室中加入細胞懸液，下室中則加入含藥高濃度血清培養(yǎng)基。48h后，取出Transwell小室，使用甲醛固定細胞，結(jié)晶紫進行染色。PBS洗滌2遍，在倒置顯微鏡下進行細胞計數(shù)。

7.Western blot法檢測：提取A549、H1650和腫瘤組織的總蛋白。12%SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，然后電轉(zhuǎn)至 PVDF膜(美國賽默飛世爾科技公司)。5%脫脂牛奶進行膜封閉，隨后選用一級抗體在4冰箱搖床孵育。次日，HRP標(biāo)記二抗孵育，用ECL試劑盒檢測信號。一級抗體購自美國Cell Signaling Technology公司：Bax(1∶1000，#5023)、Bcl-2(1∶1000，#15071)、E-cadherin(1∶1000，#3195)、N-cadherin(1∶1000，#13116)、vimentin(1∶1000，#5741)、Snail(1∶1000，#3879)、PTEN(1∶1000，#9188)、p-Akt(1∶1000，#4060)、Akt(1∶1000，#4685)。

結(jié) 果

1.苦參堿降低了人肺癌細胞A549和H1650的細胞活性：本研究將人肺癌細胞A549和H1650作為體外細胞模型。用0.5、1.0、2.0mg/ml濃度的苦參堿處理細胞后，MTT 結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞活性伴隨著苦參堿濃度不斷升高而顯著降低，細胞增殖被抑制(圖1A)。AnnexinV/PI染色和Western blot法檢測結(jié)果表明，苦參堿誘導(dǎo)細胞凋亡，細胞凋亡率不斷升高，促凋亡蛋白Bax表達上調(diào)以及抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào)(圖1)。同時，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)苦參堿處理濃度為1.0和2.0mg/ml時，細胞活性沒有很顯著差異，因此選取1.0mg/ml作為后續(xù)研究濃度。

圖1 苦參堿對細胞活性和細胞凋亡的影響A.MTT檢測細胞活性; B.Annexin V/PI染色結(jié)果; C.Western blot法檢測凋亡相關(guān)蛋白表達。與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01, ***P=0.000

2.苦參堿抑制A549和H1650的細胞遷移和侵襲：本研究中，苦參堿(1.0mg/ml)處理A549和H1650細胞48h后，劃痕實驗顯示苦參堿處理后，細胞運動距離變短，遷移能力減弱(圖2A)；Transwell實驗表明細胞侵襲能力也隨之減弱(圖2B)。

圖2 苦參堿抑制細胞遷移和侵襲A.劃痕實驗表明苦參堿減弱細胞遷移能力; B.Transwell實驗表明苦參堿減弱細胞侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×100)

3.苦參堿抑制A549和H1650的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程:苦參堿(1.0mg/ml)處理A549和H1650細胞48h后，應(yīng)用Western blot法檢測EMT相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin、vimentin和Snail表達(圖3)，結(jié)果表明，E-cadherin表達顯著上調(diào)，N-cadherin、vimentin和Snail表達顯著下調(diào)。

圖3 Western blot法檢測EMT相關(guān)蛋白表達

4.苦參堿調(diào)控PTEN/PI3K/Akt通路：本研究用苦參堿(1.0mg/ml)處理A549和H1650細胞48h后，Western blot法和qRT-PCR檢測相關(guān)蛋白PTEN，p-Akt和Akt表達(圖4)。

圖4 Western blot法檢測PTEN/PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白

5.體內(nèi)實驗研究苦參堿對非小細胞肺癌的影響：本研究成功構(gòu)建了非小細胞肺癌小鼠模型，并用苦參堿溶液(75mg/kg)腹腔注射處理，連續(xù)給藥2周。測量小鼠的腫瘤體積及重量(圖5A)，并且觀察腫瘤形態(tài)(圖5B)。發(fā)現(xiàn)苦參堿溶液處理后，腫瘤體積和重量均減小。Western blot法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PTEN和E-cadherin表達上調(diào)，p-Akt、N-cadherin、vimentin和Snail蛋白表達下調(diào)(圖5C～D)。

圖5 苦參堿對體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移侵襲的影響A.腫瘤體積及重量變化; B.腫瘤形態(tài); C.PTEN/PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白表達; D.EMT相關(guān)蛋白表達

討 論

EMT能夠使腫瘤細胞獲得侵襲和向遠處轉(zhuǎn)移的能力，進而侵入周圍組織并形成轉(zhuǎn)移灶，與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[14]。本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠抑制人肺癌細胞遷移和侵襲，因此進一步研究苦參堿對EMT過程的影響。有研究報道PTEN能夠抑制PI3K/Akt通路，進而影響細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲[15,16]。

在EMT過程中，腫瘤上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞，并獲得侵襲和向遠處遷移能力[17]。腫瘤中央處的細胞常為上皮細胞表型，周圍細胞常呈間質(zhì)細胞表型，周圍的細胞常具有較強的運動能力，使腫瘤細胞侵入循環(huán)系統(tǒng)而轉(zhuǎn)移至靶器官[18]。這是惡性腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程中關(guān)鍵的一步。目前已知苦參堿能夠抑制多種腫瘤生長，而且抑制EMT的發(fā)生，進而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲。然而，苦參堿在非小細胞肺癌的作用機制仍不清楚。本研究探討了中藥單體苦參堿對非小細胞肺癌生長和EMT過程的影響及其作用機制。

本研究選取A549和H1650作為人肺癌細胞體外模型。用0.5、1.0、2.0mg/ml濃度的苦參堿處理細胞，發(fā)現(xiàn)苦參堿減弱了人肺癌細胞的細胞活性，促進了細胞凋亡，并且伴隨濃度依賴性。同時，苦參堿能夠抑制人肺癌細胞遷移和侵襲。研究結(jié)果表明，苦參堿在非小細胞肺癌治療中能夠發(fā)揮作用。已知EMT過程與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，本研究通過進一步檢測EMT相關(guān)蛋白表達，確定苦參堿在EMT過程中發(fā)揮的作用。

E-cadherin能夠使腫瘤細胞之間相互黏附，當(dāng)?shù)鞍妆磉_下降時，腫瘤上皮細胞發(fā)生EMT過程，并且向遠處轉(zhuǎn)移[19]。本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿(1.0mg/ml)處理后，E-cadherin表達顯著上調(diào)，N-cadherin、vimentin和Snail表達顯著下調(diào)，腫瘤細胞相互間的黏附作用增強，EMT過程被抑制。同時，有研究報道PTEN 能夠抑制PI3K/Akt通路，而PI3K/Akt通路能夠調(diào)控EMT 關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Snail，進而調(diào)控EMT過程[20]。本研究檢測了PTEN/PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白，發(fā)現(xiàn)苦參堿(1.0mg/ml)處理后PTEN表達增多，p-Akt表達下調(diào)，進而影響了EMT過程。

本研究首先通過細胞實驗證明了苦參堿通過PTEN/PI3K/Akt通路調(diào)控非小細胞肺癌EMT過程，進而影響細胞遷移和侵襲。成功構(gòu)建了非小細胞肺癌小鼠模型，并用苦參堿溶液(75mg/kg)腹腔注射處理。連續(xù)給藥一段時間后，處死小鼠，發(fā)現(xiàn)苦參堿抑制了腫瘤生長，并且引起PTEN/PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白和EMT相關(guān)蛋白表達發(fā)生顯著變化。通過體內(nèi)實驗，證明了苦參堿能夠影響上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程進而影響腫瘤轉(zhuǎn)移。

本研究通過體外和體內(nèi)實驗研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿不僅能夠影響腫瘤細胞生長，而且能夠通過PTEN/PI3K/Akt通路調(diào)控非小細胞肺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而影響細胞遷移和侵襲。本研究為非小細胞肺癌的中藥治療及其相關(guān)研究提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。