魯帥奇 楊凌博 秦帥鋒 張 寒 孫建濤

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤之一，致病因素包括抽煙、環(huán)境因素等[1,2]。膀胱癌患者男性多于女性，發(fā)生率隨年齡增長逐漸增高[3]。膀胱癌患者復(fù)發(fā)比例和轉(zhuǎn)移率較高，嚴(yán)重威脅患者生命健康[4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)均是非編碼RNA，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的癌變、增殖、凋亡、遷移等過程，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到關(guān)鍵作用[5,6]。miR-1290在口腔鱗狀細(xì)胞癌、胰腺癌、胃癌等多種腫瘤組織或血清中高表達，顯著促進腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[7,8]。有研究顯示，miR-1290在膀胱癌細(xì)胞中表現(xiàn)為促癌因子作用[9]。KIZ-AS1是近年來發(fā)現(xiàn)的lncRNA，由562個核苷酸構(gòu)成，目前關(guān)于KIZ-AS1在膀胱癌組織中的表達、作用及與miR-1290的靶向關(guān)系未見報道。本研究旨在觀察KIZ-AS1在膀胱癌組織和細(xì)胞系中的表達，探討KIZ-AS1對miR-1290/CDC73軸的調(diào)控作用及對膀胱癌細(xì)胞增殖和遷移的影響。

材料與方法

1.臨床標(biāo)本：選取2017年9月～2020年12月鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院泌尿外科膀胱癌根治性手術(shù)切除37例癌組織和癌旁組織，所有患者術(shù)前均未行放療和化療，本研究經(jīng)鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會同意，患者均簽署知情同意書。其中男性29例，女性8例，平均年齡為57.19±13.15歲；病理分級按照WHO(2004年)病理分級標(biāo)準(zhǔn)：1級7例，2級17例，3級13例；臨床分期按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ta～T125例，T2～T412例。所有組織術(shù)后立即于液氮中保存，所有標(biāo)本均經(jīng)筆者醫(yī)院兩名以上病理科醫(yī)生確診。

2.細(xì)胞與試劑：膀胱癌細(xì)胞系(RT-4、BIU-87、T24、5637)和膀胱上皮永生化細(xì)胞(SV-HUC-1)購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心。KIZ-AS1慢病毒、陰性對照慢病毒、miR-1290 模擬物(mimic)、miR-NC mimic、pGL3-KIZ-AS1野生型質(zhì)粒(KIZ-AS1-WT)與突變型質(zhì)粒(KIZ-AS1-MUT)購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司。Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司。qPCR試劑盒和MTT試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司。一抗(CDC73、cyclin D3、CDK2、α-tubulin、claudin-1、E-Cadherin)和辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

3.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：將SV-HUC-1細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，將RT-4、BIU-87、T24、5637細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的5637細(xì)胞分為對照組和KIZ-AS1組，根據(jù)感染復(fù)數(shù)為30，分別感染陰性對照慢病毒和KIZ-AS1慢病毒，于感染48h后收集各組細(xì)胞進行后續(xù)實驗。

4.qPCR檢測：TRIzol法提取膀胱癌組織和細(xì)胞系總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。按照qPCR試劑盒說明書設(shè)定反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)，KIZ-AS1和CDC73 mRNA以GAPDH為內(nèi)參，miR-1290以U6為內(nèi)參。KIZ-AS1、miR-1290和CDC73 mRNA相對表達水平按照2-ΔΔCt方法計算。qPCR引物序列如下，KIZ-AS1正向引物：5′-TTTCCAGCATTTCCCATAGC-3′，反向引物：5′-CAGGTGGAATGTGGAACGA-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，反向引物：5′-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′；miR-1290正向引物：5′-TGGATTTTTGGATCAGGG-3′，反向引物：5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′；GAPDH正向引物：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′，反向引物：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′；CDC73正向引物：5′-GAGAGAGTATGGAGGACA-CGAAC-3′，反向引物：5′-ATTTGGGGCAGGTCGCTGTTCA-3′。

5.生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測和雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C：采用starBase v2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測KIZ-AS1互補結(jié)合的miRNA。將KIZ-AS1-WT、KIZ-AS1-MUT分別與miR-1290 mimic、miR-NC mimic采用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑共轉(zhuǎn)染至5637細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，分別檢測海參熒光素酶發(fā)光強度和螢火蟲熒光素酶發(fā)光強度，兩者的比值代表KIZ-AS1與miR-1290的結(jié)合力。

6.Western blot法檢測：5637細(xì)胞感染48h后，加入細(xì)胞裂解液提取總蛋白，調(diào)節(jié)每組蛋白的上樣量，采用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，進一步轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，在5%脫脂牛奶中封閉，稀釋一抗：CDC73(1∶2000稀釋)、cyclin D3(1∶3000稀釋)、CDK2(1∶2000稀釋)、E-cadherin(1∶1000)、claudin-1(1∶1000)及α-tubulin(1∶3000)，在4℃冰箱內(nèi)孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h。均勻滴加化學(xué)發(fā)光試劑，采用凝膠成像系統(tǒng)中曝光、拍照。

7.MTT法檢測：5637細(xì)胞感染48h后，按照1×103個/孔加入96孔板中，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5天后加入濃度為5%的MTT溶液20μl，正常培養(yǎng)4h，吸出上清液，加入140μl二甲基亞砜，在振蕩器振蕩10min。采用酶標(biāo)儀檢測波長450nm處的吸光度(A)值，實驗重復(fù)4次。

8.Transwell實驗檢測：5637細(xì)胞感染48h后，采用無血清培養(yǎng)基重懸5637細(xì)胞至2×105個/毫升，取180μl細(xì)胞懸液加入Transwell上室，加入600μl含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基至下室。培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，采用體積分?jǐn)?shù)1%多聚甲醛固定10min，采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%結(jié)晶紫染液染色10min，流水沖洗并風(fēng)干，采用顯微鏡(×100)下拍照、計數(shù)進入膜下的細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)4次。

結(jié) 果

1.膀胱癌組織和癌旁組織中KIZ-AS1表達水平：如圖1所示，膀胱癌組織和癌旁組織中KIZ-AS1表達分別為1.46±0.41和6.69±1.15，癌旁組織的KIZ-AS1表達是膀胱癌組織的4.58倍，顯著高于膀胱癌組織(P<0.01)。

圖1 膀胱癌組織和癌旁組織中KIZ-AS1表達水平

2.膀胱癌細(xì)胞和膀胱上皮永生化細(xì)胞細(xì)胞中KIZ-AS1表達水平：膀胱癌RT-4、BIU-87、T24、5637細(xì)胞中KIZ-AS1的表達分別為0.53±0.07、0.63±0.03、0.35±0.04、0.17±0.03，明顯低于膀胱上皮永生化細(xì)胞SV-HUC-1(1.04±0.14)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，圖2)，5637細(xì)胞中KIZ-AS1表達水平最低(P<0.01)，選擇5637細(xì)胞進行后續(xù)研究。

圖2 膀胱上皮永生化細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞中KIZ-AS1表達水平與SV-HUC-1細(xì)胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.對照組和KIZ-AS1組5637細(xì)胞中KIZ-AS1的表達水平：qPCR結(jié)果顯示，KIZ-AS1組和對照組5637細(xì)胞中KIZ-AS1表達分別為11.29±1.87和1.06±0.25，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

4.過表達KIZ-AS1抑制5637細(xì)胞增殖活力：MTT法結(jié)果顯示，從第2天起，KIZ-AS1組5637細(xì)胞增殖活力顯著低于對照組(P<0.05，圖3)。

圖3 MTT檢測KIZ-AS1對5637細(xì)胞增殖活力的影響與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.過表達KIZ-AS1抑制5637細(xì)胞遷移能力：Transwell實驗顯示，對照組和KIZ-AS1組5637細(xì)胞遷移數(shù)分別為71.53±6.23個和26.87±3.88個，與對照組比較，過表達KIZ-AS1可明顯抑制5637細(xì)胞遷移(P<0.01，圖4)。

圖4 Transwell實驗檢測KIZ-AS1對5637細(xì)胞遷移能力的影響A.Transwell實驗檢測KIZ-AS1對膀胱癌細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×100)；B.細(xì)胞遷移數(shù)的半定量分析

6.生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CKIZ-AS1的潛在機制：利用starBase v2.0數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-1290可能是KIZ-AS1的靶基因，預(yù)測序列見圖5。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-1290組KIZ-AS1-WT細(xì)胞中相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，KIZ-AS1-MUT細(xì)胞中相對熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05，圖6)。

圖5 生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測KIZ-AS1的潛在機制

圖6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞CKIZ-AS1的潛在機制

7.過表達KIZ-AS1的5637細(xì)胞中miR-1290和CDC73 mRNA表達變化：qPCR檢測顯示，對照組和KIZ-AS1組5637細(xì)胞miR-1290的表達分別為1.11±0.15和0.40±0.09，過表達KIZ-AS1顯著下調(diào)miR-1290的表達(P<0.01)。對照組和KIZ-AS1組5637細(xì)胞CDC73 mRNA的表達分別為1.02±0.17和4.94±0.90，過表達KIZ-AS1顯著上調(diào)CDC73 mRNA的表達(P<0.01)。

8.過表達KIZ-AS1促進CDC73蛋白表達：Western blot法檢測結(jié)果顯示，過表達KIZ-AS1后5637細(xì)胞中CDC73蛋白表達明顯增加，細(xì)胞增殖蛋白如cyclin D3、CDK2表達降低，細(xì)胞遷移蛋白如claudin-1、E-cadherin表達明顯增加，提示5637細(xì)胞的增殖和遷移能力明顯降低(圖7)。

圖7 Western blot法檢測CDC73蛋白及細(xì)胞功能蛋白表達情況

討 論

lncRNA是一大類長度>200個核苷酸的內(nèi)源性單鏈RNA，已被證明在各種惡性腫瘤組織或外周血清中異常上調(diào)或下調(diào)，表現(xiàn)為促癌因子或抑癌因子作用[10～12]。伴隨測序技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的lncRNA被發(fā)現(xiàn)在膀胱癌細(xì)胞中發(fā)揮重要功能[13, 14]。Zhang等[15]研究表明，在膀胱癌組織中發(fā)現(xiàn)lncRNA BCAR4表達升高，沉默lncRNA BCAR4可通過調(diào)節(jié)miR-370-3p表達，抑制膀胱癌5637和T24細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。He等[16]研究表明，lncRNA ZNF503-AS1在膀胱癌組織中降低，過表達ZNF503-AS1可通過與轉(zhuǎn)錄因子GATA6結(jié)合，減弱膀胱癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進膀胱癌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織比較，膀胱癌組織中KIZ-AS1相對表達水平顯著降低；與膀胱上皮永生化細(xì)胞比較，膀胱癌細(xì)胞系中KIZ-AS1相對表達水平明顯降低；過表達KIZ-AS1可抑制膀胱癌5637細(xì)胞的增殖和遷移，提示KIZ-AS1低表達可能與膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，KIZ-AS1在膀胱癌細(xì)胞中可能發(fā)揮抑癌因子作用。

lncRNA主要通過競爭性結(jié)合miRNA應(yīng)答元件，降低miRNA表達水平，阻止miRNA與靶基因mRNA的結(jié)合，促進靶基因mRNA的表達[17, 18]。本研究利用starBase v2.0預(yù)測顯示，KIZ-AS1與miR-1290可能存在結(jié)合位點，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步證實了KIZ-AS1和miR-1290的靶向關(guān)系。近年來研究證實，miR-1290高表達與胰腺癌、結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)，外周血miR-1290高表達是腫瘤患者預(yù)后不良的重要標(biāo)志物[19, 20]。Wang等[9]研究表明，miR-1290在膀胱癌組織和細(xì)胞系中表達明顯上調(diào)，CDC73基因在膀胱癌組織和細(xì)胞系中低表達，miR-1290通過靶向抑制CDC73基因表達，促進膀胱癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。qPCR和Western blot法檢測結(jié)果顯示，過表達KIZ-AS1后，miR-1290表達明顯降低，CDC73基因表達明顯增加，表明KIZ-AS1通過競爭性結(jié)合miR-1290應(yīng)答元件，促進CDC73基因表達，抑制膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展。Western blot法檢測結(jié)果顯示，過表達KIZ-AS1后，細(xì)胞增殖蛋白如cyclin D3、CDK2表達減少，細(xì)胞遷移蛋白如claudin-1、E-cadherin表達明顯增加，表明5637細(xì)胞增殖和遷移能力明顯降低。

綜上所述，膀胱癌組織和細(xì)胞系中KIZ-AS1表達下調(diào)，KIZ-AS1通過抑制miR-1290表達，間接增高CDC73基因表達，進而抑制膀胱癌5637細(xì)胞的增殖和遷移。KIZ-AS1/miR-1290/CDC73軸的研究為膀胱癌診斷和靶向治療提供了一定的實驗依據(jù)。