胡曉晴 熊 娟 范國(guó)華 周 倩

特發(fā)性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種進(jìn)行性且可致死的慢性肺部疾病。IPF患者長(zhǎng)期預(yù)后差，在全球范圍內(nèi)的發(fā)生率逐年升高[1]。IPF以肺泡上皮細(xì)胞損傷、不受控制的肌成纖維細(xì)胞增殖和異常的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)沉積為病理特征，最終可導(dǎo)致肺泡壁的破壞和呼吸衰竭[2]。目前，IPF發(fā)生的分子機(jī)制尚未完全明確，研究表明肺組織中氧化和抗氧化失衡可加重在IPF進(jìn)展。轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是機(jī)體重要對(duì)的轉(zhuǎn)錄因子，可轉(zhuǎn)錄激活多種抗氧化基因，同時(shí)還可抑制多種纖維化疾病的進(jìn)展[3，4]。因此，探尋可激活NRF2的藥物對(duì)今后IPF的預(yù)防和治療具有重要意義。

姜酮(zingerone，ZO)是一種無(wú)毒且價(jià)格低廉的天然化合物，主要從調(diào)味植物生姜中提取，已被證實(shí)具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌和抗糖尿病活性[5～7]。既往研究表明，ZO可以通過(guò)激活NRF2減輕壓力負(fù)荷過(guò)載誘導(dǎo)的小鼠心肌纖維化[8]。但ZO是否可以改善BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化目前尚未有研究報(bào)道。本研究擬通過(guò)氣管注射博來(lái)霉素(bleomycin，BLM)的方式以建立小鼠IPF模型, 同時(shí)觀察不同劑量的ZO干預(yù)對(duì)IPF小鼠肺纖維化的影響并探討潛在機(jī)制。

材料與方法

1.材料: 博來(lái)霉素(bleomycin，BLM，純度: 99.2%，批號(hào)：M1180)購(gòu)自邁瑞達(dá)科技(北京)有限公司；姜酮(純度: ≥98%，批號(hào)：CAS122-48-5)購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；一抗：GAPDH(批號(hào)：ab8245)、collagenⅠ(批號(hào)：ab34710)、α-SMA(批號(hào)：ab7817)、NRF2(批號(hào)：ab62352)、羊抗兔 IgG (批號(hào): ab124055)購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；蘇木精-伊紅(HE)染色液試劑盒購(gòu)自深圳市達(dá)科為生物工程有限公司；馬松染色試劑盒購(gòu)自武漢卡諾斯科技有限公司。

2.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及IPF小鼠模型的建立: 本實(shí)驗(yàn)中所使用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性C57BL/6小鼠(8～10周)，體質(zhì)量為235～300g，購(gòu)自湖北省預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將 40 只小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低劑量ZO治療組及高劑量ZO治療組，每組10只。模型組、低劑量ZO治療組及高劑量ZO治療組小鼠接受氣管單次注射BLM(5mg/kg)以構(gòu)建肺纖維化模型。低劑量ZO治療組及高劑量ZO治療組小鼠于BLM注射24h后分別給予10mg/kg和20mg/kg ZO灌胃，每4天1次。28天后，通過(guò)頸椎脫臼法處死小鼠后，留取雙側(cè)肺組織。

3.HE染色: 取小鼠右肺組織，用10%甲醛溶液固定并脫水，隨后用石蠟包埋并切片。將肺石蠟切片于二甲苯和梯度乙醇中脫蠟并水化，蘇木精染細(xì)胞核，伊紅染細(xì)胞質(zhì)，脫水封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察各組肺組織的病理形態(tài)。

4.Masson染色: 將Weigert鐵蘇木精A液和Weigert鐵蘇木精B液等量混合獲得Weigert鐵蘇木精染色液，使用Weigert 鐵蘇木精染色液染色。酸性乙醇分化后，使用藍(lán)化液藍(lán)化。隨后使用麗春紅品紅染色液染色并使用苯胺藍(lán)染色液復(fù)染，脫水后在光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)肺纖維化水平，并根據(jù)Ashcroft評(píng)分表對(duì)各組小鼠肺纖維化進(jìn)行評(píng)分。

5.ELISA試劑盒檢測(cè)MDA，SOD及羥脯氨酸: 取凍存肺組織40～50mg，將肺組織研磨成勻漿后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)上的步驟分別檢測(cè)各組小鼠肺組織中MDA、SOD和羥脯氨酸的含量。

6.Western blot法檢測(cè): 提取各組小鼠右肺肌組織總蛋白，隨后對(duì)其進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠中的蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，隨后分別用抗collagen Ⅰ、α-SMA、NRF2及GAPDH的一抗在4℃下孵育過(guò)夜。次日，于二抗(羊抗兔)稀釋液中避光孵育50min。孵育結(jié)束后，使用Odyssey掃膜儀對(duì)各蛋白條帶掃描并定量，以GAPDH作為內(nèi)參蛋白對(duì)各樣本目的蛋白進(jìn)行校正。

結(jié) 果

1.各組小鼠肺組織HE染色及Masson染色結(jié)果： 在BLM注射后的28天，取肺組織進(jìn)行Masson染色及HE染色。結(jié)果表明，BLM刺激可明顯促進(jìn)小鼠肺組織膠原沉積和病理?yè)p傷，增加小鼠Ashcroft評(píng)分(P<0.05)。10mg/kg和20mg/kg ZO干預(yù)均可明顯減輕小鼠肺組織膠原沉積及病理?yè)p傷，降低Ashcroft評(píng)分(P<0.05)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色及Masson染色結(jié)果(×200)與對(duì)照組比較, *P<0.05；與模型組比較, #P<0.05

2.各組小鼠肺組織氧化應(yīng)激和羥脯氨酸水平的比較：接下來(lái)，BLM注射28天后，BLM刺激可明顯增加小鼠肺組織MDA水平(P<0.05)，同時(shí)抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性(P<0.05)。10mg/kg和20mg/kg ZO干預(yù)后，肺纖維化小鼠肺組織中MDA水平明顯降低(P<0.05)，SOD活性明顯增加(P<0.05)。模型組小鼠肺組織中羥脯氨酸水平較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)。10mg/kg和20mg/kg ZO干預(yù)后，肺纖維化小鼠肺組織中羥脯氨酸水平均明顯降低(P<0.05)，詳見(jiàn)圖2。

圖2 各組小鼠肺組織氧化應(yīng)激和羥脯氨酸水平的比較與對(duì)照組比較, *P<0.05；與模型組比較, #P<0.05

3.各組小鼠肺組織纖維化標(biāo)志蛋白的表達(dá)狀況：Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，模型組小鼠肺組織中collagenⅠ和α-SMA表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加(P<0.05)；10mg/kg和20mg/kgZO干預(yù)后，肺纖維化小鼠肺組織中上述兩種蛋白水平均明顯降低(P<0.05)，詳見(jiàn)圖3。

圖3 各組小鼠肺組織纖維化標(biāo)志蛋白的表達(dá)狀況與對(duì)照組比較, *P<0.05；與模型組比較, #P<0.05

4.各組小鼠肺組織NRF2的蛋白表達(dá)狀況：Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，模型組小鼠肺組織中NRF2表達(dá)水平較對(duì)照組明顯降低(P<0.05)。10mg/kg和20mg/kgZO干預(yù)后，肺纖維化小鼠肺組織中NRF2表達(dá)水均明顯升高(P<0.05)，詳見(jiàn)圖4。

圖4 各組小鼠肺組織NRF2的蛋白表達(dá)狀況與對(duì)照組比較, *P<0.05；與模型組比較, #P<0.05

討 論

肺纖維化是各種慢性肺部疾病共有的病理改變[9]。機(jī)體為修復(fù)肺間質(zhì)的慢性損傷，間質(zhì)細(xì)胞會(huì)持續(xù)分泌膠原蛋白，最終導(dǎo)致肺內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)沉積及肺組織結(jié)構(gòu)破壞[10]。正常肺組織由肺上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及巨噬細(xì)胞組成。這些細(xì)胞在病理因素，如BLM、高糖或長(zhǎng)期空氣污染的刺激下可通過(guò)不同機(jī)制導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生[11]。例如，成肺纖維細(xì)胞可通過(guò)增殖分化為肌成纖維細(xì)胞，產(chǎn)生大量膠原沉積于細(xì)胞外基質(zhì)； 2型上皮細(xì)胞不僅可以通過(guò)細(xì)胞凋亡的方式導(dǎo)致肺上皮再生受損及肺骨架缺失，還可通過(guò)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的方式增加間質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，最終導(dǎo)致肺纖維化進(jìn)展[12]。此外，內(nèi)皮細(xì)胞則可通過(guò)內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的方式加重肺纖維化[13]。巨噬細(xì)胞在病理刺激下，可由M1轉(zhuǎn)化為M2型，產(chǎn)生促纖維化因子包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β，TGF-β)和血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)，導(dǎo)致肺纖維化[14]。因此，以上述細(xì)胞為靶點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)，是肺纖維化防治的重要策略。

在肺纖維化的進(jìn)展過(guò)程中，氧化應(yīng)激被明顯激活。例如，大量ROS可導(dǎo)致肺上皮細(xì)胞DNA損傷和凋亡，通過(guò)誘發(fā)TGF-β的激活和釋放；此外ROS還可促進(jìn)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化[15，16]。研究顯示，NRF2在多種疾病模型中可顯著抑制細(xì)胞內(nèi)ROS生成，同時(shí)，NRF2還可轉(zhuǎn)錄激活多種抗氧化基因，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。NRF2基因敲除小鼠相較于野生型小鼠在BLM刺激下更易產(chǎn)生肺纖維化表型[17]。體外實(shí)驗(yàn)也表明，NRF2 抑制不僅增加了成纖維細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，還誘導(dǎo)了其向肌成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化[18，19]。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NRF2是干預(yù)肺纖維化的重要靶點(diǎn)。

ZO作為一種生姜中提取的天然化合物，具有重要的抗纖維化作用，包括心肌纖維化和肝臟纖維化。在心肌纖維化中，ZO可通過(guò)激活eNOS/NRF2軸抑制氧化應(yīng)激進(jìn)而減輕心肌組織中膠原纖維合成，發(fā)揮心臟保護(hù)作用[8]。在非酒精性脂肪肝中，ZO可通過(guò)改善小鼠血糖、血脂、肝功能進(jìn)而減輕肝臟纖維化[20]。本研究中筆者發(fā)現(xiàn)，兩種劑量的ZO干預(yù)不僅可明顯減輕小鼠肺組織病理?yè)p傷和肺間質(zhì)膠原沉積，還可抑制小鼠肺組織纖維化。機(jī)制上，ZO可明顯上調(diào)IPF小鼠肺組織中NRF2的表達(dá)。

綜上所述，ZO可能通過(guò)激活NRF2改善BLM誘導(dǎo)小鼠肺纖維化和氧化應(yīng)激，發(fā)揮肺保護(hù)作用。