宋彬彬 甄 然 彭 宇 丁思妍 楊 璇 于 佳

微管是真核細胞中重要的骨架結(jié)構(gòu)和胞內(nèi)運輸軌道，其散布于胞質(zhì)中，對于維持細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能具有重要作用[1]。微管正端示蹤蛋白可特異定位于微管正端，具有保守的特定序列和復雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，參與調(diào)控微管的動態(tài)變化，影響細胞內(nèi)微管依賴的各種生物學過程。微管末端結(jié)合蛋白1(end-binding protein 1，EB1)可自發(fā)的定位于微管正端，呈彗星狀分布，能招募含特定序列的多種蛋白在微管正端的聚集，是形成微管正端示蹤蛋白網(wǎng)絡(luò)的中心分子[2,3]。近年來有報道顯示口腔鱗狀細胞癌患者中EB1過表達[4]。佩里綜合征患者致病基因DCTN1的突變位點位于其與EB1相互作用結(jié)構(gòu)域[5]。以上提示EB1含量和功能異常與多種疾病發(fā)生相關(guān)。本研究通過生化方法以1.5月齡野生型小鼠、成纖維細胞和HEK293細胞為材料，檢測EB1在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)和細胞中表達和分布，以及EB1在細胞自噬通路中的作用。

材料與方法

1.主要儀器和試劑：siRNA轉(zhuǎn)染試劑購自德國QIAGEN公司；10% SDS溶液、蛋白酶抑制劑、蛋白定量試劑盒、蛋白電泳預制膠、超聲波細胞破碎儀、熒光標記二抗以及封片液購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Turbo轉(zhuǎn)印包、Trans-Blot Turbo轉(zhuǎn)印系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；雞抗神經(jīng)絲重鏈(neurofilament heavy chian，NFH)單克隆抗體、山羊抗p150glued多克隆抗體購自英國Abcam公司；鼠抗EB1單克隆抗體購自美國BD公司；兔抗EB1多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體購自美國Sigma-Aldrich公司；豚鼠抗p62多克隆抗體購自日本MBL Life Science公司；兔抗LC3B多克隆抗體購自美國Novus Biologicals公司；熒光標記二抗、Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)購自美國LI-COR公司。

2.實驗動物：野生型C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，根據(jù)實驗動物相關(guān)規(guī)定進行管理和操作。迅速取材小鼠眼(eye)、嗅球(olfactory bulb,OB)、皮質(zhì)(cortex,CX)、海馬(hippocampus,HC)、紋狀體(striatum,Str)、中腦(midbrain,Mid)、小腦(cerebellum,CB)、腦干(brainstem,BS)、脊髓(spinal cord,SC)、坐骨神經(jīng)(sciatic nerve,SN)和腓腸肌(gastrocnemius muscle)，凍存于-80℃冰箱。

3.細胞培養(yǎng)與傳代：小鼠原代成纖維細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于含5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱。HEK293細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)于含5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。顯微鏡下觀察細胞生長至80%～90%時用1×TrypLETMExpress Enzyme消化、傳代，待細胞增殖旺盛、狀態(tài)良好時進行實驗。

4.siRNA轉(zhuǎn)染:細胞消化后，按照每孔5×105個細胞傳代到6孔板中，按照QIAGEN公司HiPerFect Transfection Reagent轉(zhuǎn)染試劑說明書進行EB1 siRNA和scrambled siRNA轉(zhuǎn)染。

5.蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達水平:1% SDS裂解液裂解HEK293細胞或小鼠組織樣品，超聲破碎(25% amplitude, 10s on,10s off,3個循環(huán))，室溫離心16800×g，10min，收集上清為總蛋白提取液。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，取各組等量蛋白提取液經(jīng)10% SDS-PAGE和NuPAGE預制凝膠電泳，再將預制凝膠中蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(nitrocellulose,NC)膜上。將NC膜放入封閉液中封閉30min，加入一抗兔抗EB1、豚鼠抗p62、兔抗LC3B、鼠抗β-actin、兔抗GAPDH、雞抗NFH，4℃孵育過夜。PBST漂洗5min×3次，將NC膜放入熒光素IRDye?標記的山羊抗兔或山羊抗雞或山羊抗鼠或山羊抗豚鼠二抗中，孵育1h，PBST漂洗5min×3次，采用Odyssey凝膠成像儀檢測蛋白質(zhì)顯色，Image J軟件定量蛋白條帶的相對灰度。

6.免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)：小鼠原代成纖維細胞接種于鋪有玻片的24孔板中，貼壁后用-20℃預冷甲醇固定10min后，PBS緩沖液洗5min×3次。封閉液室溫封閉30min后，使用一抗鼠抗EB1、山羊抗p150glued室溫孵育2h，PBS緩沖液洗5min×3次，使用Alexa Fluor 488/546/647標記的二抗進行免疫染色，室溫孵育1h，PBS緩沖液洗5min×3次，封片晾干。使用Zeiss共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM880)拍照，使用Image J軟件進行圖像分析。

結(jié) 果

1.微管正端示蹤蛋白EB1在小鼠成纖維細胞中位于微管正端：免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡技術(shù)檢測結(jié)果顯示，小鼠成纖維細胞中EB1(綠色熒光)主要聚集于p150glued蛋白標記的微管(紫色熒光)的正端，且呈彗星狀分布(圖1)。

圖1 成纖維細胞中EB1蛋白表達與分布成纖維細胞中EB1(綠色熒光)、p150glued(紫色熒光)和DAPI(藍色熒光)三重免疫熒光染色

2.微管正端示蹤蛋白EB1在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中表達和分布：蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示，微管正端示蹤蛋白EB1在小鼠眼、嗅球、皮質(zhì)、海馬、紋狀體、中腦、小腦、腦干、脊髓、坐骨神經(jīng)和肌肉中都有一定表達，但其含量具有組織部位差異性(圖2中A、B)。β-actin為非肌肉型actin，在肌肉組織中不表達。與脊髓比較，小鼠坐骨神經(jīng)中EB1蛋白含量均顯著下降(圖2中C、D)。

圖2 小鼠組織中EB1蛋白表達和分布A.EB1在小鼠眼、腦、脊髓、坐骨神經(jīng)和腓腸肌中蛋白表達水平；B. EB1在小鼠眼、腦、脊髓、坐骨神經(jīng)和腓腸肌中蛋白表達水平的定量分析；C.EB1在小鼠脊髓和坐骨神經(jīng)中蛋白含量；D. EB1在小鼠脊髓和坐骨神經(jīng)中蛋白含量的定量分析

3.EB1 siRNA在HEK293細胞的自噬溶酶體通路中作用：蛋白印跡法檢測結(jié)果顯示，HEK293細胞中轉(zhuǎn)染EB1 siRNA可顯著下調(diào)EB1蛋白水平(P<0.01)。且HEK293細胞中敲減EB1可引起自噬通路中關(guān)鍵分子p62和LC3B-Ⅱ蛋白含量顯著上調(diào)(P<0.05)，而LC3B-Ⅰ蛋白水平未發(fā)生明顯變化(P>0.05，圖3)。

圖3 HEK293細胞中敲減EB1對自噬通路關(guān)鍵蛋白含量影響A.HEK293細胞中EB1含量下降引起自噬通路關(guān)鍵蛋白含量變化；B. HEK293細胞中EB1含量下降引起自噬通路關(guān)鍵蛋白含量變化的定量分析。ctrl.hek293細胞中轉(zhuǎn)染scramble siRNA;siRNA.hek293細胞中轉(zhuǎn)染EB1 siRNA

討 論

微管是真核細胞中廣泛存在的纖維管狀結(jié)構(gòu)，其兩端具有極性，負端位于近核區(qū)，聚合速度慢，較穩(wěn)定；正端指向胞質(zhì)，處于動態(tài)的聚合解聚的快速轉(zhuǎn)換狀態(tài)，即動態(tài)不穩(wěn)定性(dynamic instability)[6]。微管正端示蹤蛋白EB1通過其N端的CH結(jié)構(gòu)域(calponin homology domain, CHD)直接與微管蛋白結(jié)合，特異性聚集于微管正端。C端具有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域負責介導EB1二聚體的形成，且C端也可介導其與具有CAP-Gly和SxIP等特定修飾的微管正端示蹤蛋白相互作用[7,8]。本研究檢測了體外培養(yǎng)的野生型小鼠成纖維細胞中EB1的定位和分布，確認了EB1隨微管分散于胞質(zhì)，且在微管正端高度聚集，呈彗星狀分布。

EB1廣泛表達于機體各組織部位，參與調(diào)控微管動力學和穩(wěn)定性[9]。研究發(fā)現(xiàn)，EB1定位于生長的微管末端，可促進微管持續(xù)增長[10]。EB1功能缺失時彗星狀結(jié)構(gòu)縮短，生長的微管末端數(shù)量減少且生長速率下降，提示微管可能處于崩解狀態(tài)[11]。HeLa細胞中EBs功能缺失使Clip170和Clasp1在微管正端聚集減少，微管生長和縮短速率均顯著下降，崩解和重建頻率均顯著提高。微管負端在高爾基體聚集減少，而隨機分布于胞質(zhì)中[12]。破骨細胞中微管調(diào)控足體的形成，過表達EB1可促進破骨細胞成熟，而EB1功能缺失可通過破壞微管動態(tài)不穩(wěn)定性而抑制足體形成帶狀結(jié)構(gòu)[13]。本研究結(jié)果進一步證實，EB1在小鼠眼、嗅球、皮質(zhì)、海馬、紋狀體、中腦、小腦、腦干、脊髓、坐骨神經(jīng)以及肌肉中均有表達，且表達水平具有組織部位差異性。與脊髓比較，坐骨神經(jīng)中EB1蛋白含量均顯著下降(P<0.05)，這提示神經(jīng)元亞細胞結(jié)構(gòu)軸突束(坐骨神經(jīng))中EB1水平較低于胞體(脊髓)。而EB1對于微管具有重要調(diào)節(jié)作用，因此軸突束中EB1蛋白含量或功能的細微變化即有可能對神經(jīng)元產(chǎn)生重要影響。

自噬是一種重要的胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)控機制，是自噬小體包裹待降解貨物后通過溶酶體實現(xiàn)降解功能的細胞代謝過程。LC3B是廣泛用于檢測自噬小體形成、成熟和自噬活性的重要標志蛋白[14]。p62可選擇性募集泛素化蛋白質(zhì)，并與LC3結(jié)合，參與自噬小體的形成[15]。研究發(fā)現(xiàn)，微管及微管相關(guān)蛋白可調(diào)控自噬小體的形成、運輸及其與溶酶體的融合過程[16]。Huh-7細胞中藥物破壞微管可明顯促進自噬小體的生成[17]。Wei等[18]研究發(fā)現(xiàn)，EB1可與CAMSAP2蛋白相互作用，調(diào)節(jié)非中心體微管的動力學特性。破壞EB1與CAMSAP2的結(jié)合可影響EB1在微管末端分布，改變微管生長方向，使自噬小體逆向運輸障礙，導致LC3-Ⅱ蛋白水平提高，自噬小體積累。本研究發(fā)現(xiàn)，HEK293細胞中敲減EB1可引起p62和LC3A/B-Ⅱ蛋白含量顯著上調(diào)(P<0.05)，這提示EB1缺失可能通過引起微管正端結(jié)構(gòu)和功能障礙而引起自噬小體積累，導致自噬異常。

綜上所述，微管正端示蹤蛋白EB1可招募蛋白質(zhì)在微管正端的定位，是連接微管正端示蹤蛋白網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵分子，對于調(diào)控微管穩(wěn)定性和動力學具有重要作用[19]。本研究檢測了EB1在小鼠經(jīng)系統(tǒng)中的表達，發(fā)現(xiàn)其廣泛存在且具有組織部位特異性。與胞體比較，軸突束中EB1蛋白含量顯著下降。EB1特異性聚集于微管正端，在HEK293細胞中敲減EB1可能通過破壞微管正端結(jié)構(gòu)和功能，減少自噬小體的形成和運輸，從而引起自噬異常。自噬異常與神經(jīng)元損傷和死亡密切相關(guān)[20]。本研究可為揭示微管正端示蹤蛋白EB1如何參與神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供科學依據(jù)。