陳 志，朱衛(wèi)東，郭凌川

冷凍切片制作是將新鮮的病變組織與OCT包埋劑在低溫環(huán)境下快速冷凍后切成薄片的過(guò)程。冷凍切片制作流程簡(jiǎn)便、迅速，有助于外科醫(yī)師判斷病變的良惡性，及時(shí)決定手術(shù)方式。準(zhǔn)確的病理診斷結(jié)果依賴優(yōu)質(zhì)、高效的冷凍切片制作，影響冷凍切片質(zhì)量的因素較多，如取材、溫度、切片、染色等，而冷凍時(shí)間是影響制片優(yōu)劣的重要因素之一[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較兩種不同冷凍方法的制片速度和質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)一種方便易行的組織速凍方法，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院手術(shù)室送檢的行術(shù)中快速冷凍病理檢查標(biāo)本50例，其中乳腺8例，肺12例，甲狀腺12例，子宮肌瘤10例，前哨淋巴結(jié)8例。

1.2 儀器與試劑ThermoFisherNX50冷凍切片機(jī)，Olympus BX31光學(xué)顯微鏡，95%乙醇固定液，Gill蘇木精，0.25%醇溶性伊紅，無(wú)水乙醇，中性樹(shù)膠等。

1.3 方法將50例標(biāo)本平均分為2組，每組含乳腺4例，肺6例，甲狀腺6例，子宮肌瘤5例，前哨淋巴結(jié)4例。采用兩種方法制片：(1)冷凍臺(tái)冷凍法：將組織放入組織托上添加適量的OCT包埋劑，置于冷凍切片機(jī)冷凍臺(tái)上進(jìn)行冷凍。(2)改良冷凍法：將組織放入組織托，加入OCT包埋劑。在冷凍切片機(jī)冷凍臺(tái)凹槽里加少許無(wú)水乙醇，使其鋪滿凹槽底部，再將組織托放入冷凍凹槽進(jìn)行速凍。組織冷凍后行常規(guī)冷凍切片、HE染色、中性樹(shù)膠封固。

1.4 結(jié)果判定HE切片根據(jù)切片完整度、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、染色強(qiáng)度、染色對(duì)比度、有無(wú)空泡、冰晶、裂隙等因素進(jìn)行評(píng)分。冷凍切片質(zhì)量評(píng)分等級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：滿分為100分，90分以上為甲級(jí)片，80～89分為乙級(jí)片，60～79分為丙級(jí)片，60分以下為丁級(jí)片。所有切片均經(jīng)兩位主治醫(yī)師獨(dú)立判斷評(píng)分。

2 結(jié)果

2.1 兩種冷凍方法的冷凍時(shí)間對(duì)比冷凍時(shí)間以組織托放入冷凍槽內(nèi)開(kāi)始計(jì)時(shí)，以組織及周圍OCT包埋劑完全凝固為結(jié)束時(shí)間，分別記錄每個(gè)組織樣本的冷凍時(shí)間。單因素方差分析的方差齊性檢驗(yàn)表明本組實(shí)驗(yàn)不適用于單因素方差分析，遂改用非參數(shù)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)，結(jié)果表明改良冷凍法的組織冷凍時(shí)間明顯低于冷凍臺(tái)冷凍法，差異有顯著性(P<0.001，表1)。

表1 兩種冷凍方法的組織冷凍時(shí)間

2.2 兩種冷凍方法的制片質(zhì)量對(duì)比將所有切片評(píng)分后根據(jù)組織類型分類，比較兩種方法的區(qū)別。單因素方差分析結(jié)果表明，改良冷凍法處理乳腺、肺、甲狀腺、子宮肌瘤、前哨淋巴結(jié)的得分均高于冷凍臺(tái)冷凍法，差異有顯著性(P均<0.05，表2)。

表2 兩種冷凍方法的制片質(zhì)量評(píng)分

鏡下觀察兩種方法制片行HE染色后冰晶出現(xiàn)情況，鏡下發(fā)現(xiàn)經(jīng)冷凍臺(tái)冷凍法處理的組織內(nèi)形成大量冰晶，細(xì)胞核受擠壓，有空洞，細(xì)胞間有不規(guī)則裂隙，組織結(jié)構(gòu)形態(tài)變化明顯；經(jīng)改良冷凍法處理的組織中冰晶較少，組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)空洞、裂隙，染色均勻(圖1、2)。

圖1 冷凍臺(tái)冷凍法：A.甲狀腺；B.子宮肌瘤；C.前哨淋巴結(jié) 圖2 改良冷凍法：A.甲狀腺；B.子宮肌瘤；C.前哨淋巴結(jié)

2.3 兩種冷凍方法的報(bào)告時(shí)間對(duì)比記錄每個(gè)標(biāo)本從接受到報(bào)告簽發(fā)的時(shí)間。改良冷凍法的平均報(bào)告時(shí)間為21.3 min，冷凍臺(tái)冷凍法的平均報(bào)告時(shí)間為33.6 min。冷凍臺(tái)冷凍法的報(bào)告超時(shí)率為40%(10/25)，改良冷凍法的報(bào)告超時(shí)率為4%(1/25)。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)結(jié)果分析顯示，改良冷凍法的平均報(bào)告時(shí)間明顯低于冷凍臺(tái)冷凍法，差異有顯著性(P<0.001，表3)。

表3 兩種冷凍方法的報(bào)告時(shí)間

3 討論

冷凍速度是冷凍切片成敗的關(guān)鍵。冷凍速度慢、時(shí)間長(zhǎng)導(dǎo)致組織內(nèi)產(chǎn)生大量冰晶[2]。組織在緩慢冷凍的過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)外的水分子逐漸凝結(jié)，形成較大的冰晶顆粒，從而擠壓細(xì)胞核或使細(xì)胞間隙增大，待切片染色時(shí)冰晶融化留下大量的空泡、空核，組織形態(tài)上也會(huì)出現(xiàn)間隙增大，組織結(jié)構(gòu)改變等假象，嚴(yán)重影響病理診斷的準(zhǔn)確性[3]。

在較短的時(shí)間內(nèi)達(dá)到組織所需的冷凍溫度，是減少冰晶生成的有效方法[4]。傳統(tǒng)的冷凍臺(tái)冷凍法利用組織托的傳導(dǎo)性將低溫從冷凍臺(tái)傳導(dǎo)到組織上，與以下因素有關(guān)：(1)組織托與冷凍臺(tái)并非完全貼合。(2)低溫傳導(dǎo)方向自下而上，越往組織表面?zhèn)鲗?dǎo)速度越慢。改良冷凍法在組織托和冷凍臺(tái)凹槽之間加入無(wú)水乙醇作為傳導(dǎo)媒介，增大了組織托與冷凍臺(tái)的接觸面積。此外，無(wú)水乙醇的冰點(diǎn)為-114 ℃，低溫下不會(huì)凝結(jié)且有良好的冷傳導(dǎo)效率，因而能加速組織的冷凍，明顯縮短冷凍時(shí)間，最大程度的減少冰晶的產(chǎn)生。在組織底部基本凝固，表面少許OCT尚未凝固時(shí)，可放置冷凍錘于組織表面，加速表面組織的冷凍，進(jìn)一步縮短冷凍時(shí)間[5]。另外，取材時(shí)應(yīng)避免用水沖洗標(biāo)本，組織血水較多時(shí)需用紗布吸去表面的水分，也可減少冰晶的產(chǎn)生。

綜上所述，改良冷凍法可以有效地減少冰晶的產(chǎn)生，值得臨床應(yīng)用和推廣。制作出高質(zhì)量的冷凍切片是病理技術(shù)人員不斷追求的目標(biāo)。一張高質(zhì)量的冷凍切片除考慮冷凍時(shí)間外還需考慮多方面因素，如取材大小、厚度、切片技術(shù)、染色流程等[6]。只有在工作中不斷地探索、學(xué)習(xí)、改進(jìn)，才能使技術(shù)水平不斷地提高。