劉莎莎，趙 楊，趙 醒，劉 歡，申興斌

胃癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率及病死率均較高的惡性腫瘤，嚴(yán)重影響著人類(lèi)的健康[1]。我國(guó)胃癌臨床診治特點(diǎn)是中晚期多見(jiàn)，以手術(shù)治療為主，術(shù)后化療+靶向治療為輔，患者存活期短[2]。目前臨床上用于治療胃癌的靶向藥物較少，迫切需要尋找新的治療靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，連接蛋白43(connexin 43, CX43)介導(dǎo)的細(xì)胞間隙連接(gap junction intercellular communciation, GJIC)在腫瘤中的表達(dá)水平和膜定位可影響癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移[3]。在惡性腫瘤中，PI3K/AKT/mTOR通路的異?；罨梢种颇[瘤細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及新生血管的形成[4]。其中下游mTOR/p70S6K信號(hào)通路被異常激活后，可使磷酸化的p70S6K轉(zhuǎn)錄和翻譯活性增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞G1期→S期的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的無(wú)限生長(zhǎng)及增殖。CX43是否直接或間接地通過(guò)與mTOR/p70S6K的相互作用參與調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用免疫組化法、Western blot法及qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)CX43、mTOR和p70S6K蛋白及mRNA在胃癌及正常胃黏膜組織中的表達(dá)，并分析其相關(guān)性，為研究胃癌的發(fā)病機(jī)制及靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院存檔的60例胃癌手術(shù)切除標(biāo)本(患者術(shù)前均未行放療及化療)及相應(yīng)癌旁正常胃黏膜組織(距癌灶5 cm以上)，一部分新鮮組織置于-80 ℃冰箱保存用于Western blot及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，另一部分組織制成蠟塊用于免疫組化染色。

1.2 免疫組化

1.2.1主要試劑 一抗兔抗人CX43多克隆抗體及mTOR單克隆抗體均購(gòu)自杭州華安生物公司，兔抗人p70S6K多克隆抗體購(gòu)自武漢ABclonal公司，免疫組化試劑及DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2.2染色步驟 所有標(biāo)本固定后，常規(guī)脫水、石蠟包埋，5 μm厚切片，脫蠟及水化，抗原修復(fù)、封閉、滴加一抗等，具體步驟嚴(yán)格按SP試劑盒及DAB顯色說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，采用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.3結(jié)果判定 CX43、mTOR及p70S6K抗體陽(yáng)性著色分布于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野，采用Vlom雙評(píng)分法進(jìn)行評(píng)分：(1)按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分。(2)按染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加作為最終結(jié)果：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3～4分為中等陽(yáng)性()，5～6分為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.3 Western blot法

1.3.1主要試劑 一抗同免疫組化抗體試劑，兔單抗β-actin購(gòu)自武漢ABclonal公司，RIPA裂解液購(gòu)自索萊寶公司，BCA法蛋白定量試劑盒購(gòu)自杭州聯(lián)科公司；Sample Buffer(5×)購(gòu)自貝博公司；新快速SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購(gòu)自莊盟公司等。

1.3.2檢測(cè)步驟 取0.1 g新鮮胃癌及正常胃黏膜組織，嚴(yán)格按裂解液試劑盒說(shuō)明提取蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)目的蛋白分子量大小分別制6%分離膠+5%濃縮膠和10%分離膠+5%濃縮膠，80 V條件電泳，待樣品越過(guò)兩種膠體分界面，改為120 V電泳，直至所需條帶跑出。200 mA低溫轉(zhuǎn)膜，時(shí)間視分子大小而定。一抗[β-actin(1 ∶100 000)、CX43(1 ∶6 000)、mTOR(1 ∶200)、p70S6K(1 ∶10 000)]搖勻2 h后4 ℃過(guò)夜。次日，5%脫脂奶粉搖勻封閉2 h，滴加稀釋后的二抗(1 ∶10 000)搖勻，約1 h，TBST清洗10 min×3次。ECL發(fā)光液按1 ∶1配置后，滴在濾紙輕度干燥后的PVDF膜上，于暗室內(nèi)進(jìn)行顯影，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以膠片上條帶的方式呈現(xiàn)。

1.3.3結(jié)果分析 所得圖像運(yùn)用Image J分析得到灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。

1.4 qRT-PCR

1.4.1主要試劑 RNA提取試劑盒購(gòu)自Foregene公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及擴(kuò)增試劑盒均購(gòu)自武漢ABclonal公司等。各指標(biāo)引物序列均經(jīng)GeneCopoeia公司設(shè)計(jì)。

1.4.2檢測(cè)步驟 所用EP管、移液器及槍頭、八連管等均經(jīng)無(wú)酶處理。嚴(yán)格按照RNA提取試劑盒步驟提取胃癌組織及正常胃黏膜組織中的總RNA，用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度(以O(shè)D260/280比值在1.8～2.1為合格)。反轉(zhuǎn)錄為20 μL體系(總RNA 1 pg～1 μg，5×ABScript Ⅱ RT Mix 4 μL，Nuclease-free H2O補(bǔ)足至20 μL)，在PCR儀上按25 ℃ 5 min，42 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，12 ℃ Hold進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。擴(kuò)增為20 μL體系(2× Universal SYBR Green Fast qPCR Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，引物2 μL，Nuclease-free H2O 6 μL)，在CFX96 qRT-PCR儀按照95 ℃ 3 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30～34 s，40～45個(gè)循環(huán)進(jìn)行操作。

1.4.3結(jié)果 所得擴(kuò)增曲線(xiàn)、溶解曲線(xiàn)及CT值，計(jì)算2-△△Ct，其中ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組，數(shù)據(jù)匯總，對(duì)2-△△Ct進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及正常胃黏膜組織中CX43、mTOR及p70S6K蛋白表達(dá)

2.1.1免疫組化結(jié)果 CX43、mTOR及p70S6K陽(yáng)性均定位于細(xì)胞質(zhì)，胃癌組織中CX43蛋白表達(dá)明顯低于正常胃黏膜組織(P<0.05，表1，圖1)。胃癌組織中mTOR及p70S6K蛋白表達(dá)則明顯高于正常胃黏膜組織(P<0.05，表1，圖2、3)。

表1 胃癌及正常胃黏膜組織中CX43、mTOR及p70S6K蛋白表達(dá)

2.1.2Western blot結(jié)果 胃癌組織中，CX43蛋白表達(dá)量低于正常胃黏膜組織，mTOR及p70S6K蛋白表達(dá)量則高于正常胃黏膜組織(P均<0.01，圖4)。

圖4 胃癌及正常胃黏膜組織中CX43、mTOR和p70S6K蛋白表達(dá)：

2.1.3qRT-PCR結(jié)果 胃癌組織中CX43 mRNA表達(dá)量低于正常胃黏膜組織，mTOR及p70S6K mRNA表達(dá)量則高于正常胃黏膜組織(P均<0.01，圖5)。

圖5 胃癌及正常胃黏膜組織中CX43、mTOR及p70S6K mRNA的表達(dá)

2.2 胃癌組織中CX43、mTOR及p70S6K表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系胃癌組織中CX43蛋白及mRNA隨著胃癌分化程度的降低、臨床分期越晚、浸潤(rùn)程度越深、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，其表達(dá)量降低，mTOR和p70S6K蛋白及mRNA表達(dá)則與CX43相反(P均<0.05，表2～4)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CX43、mTOR及p70S6K表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期、浸潤(rùn)深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與患者性別、年齡無(wú)關(guān)。

表2 胃癌組織中CX43、mTOR及p70S6K蛋白表達(dá)(免疫組化)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 胃癌組織中CX43、mTOR及p70S6K表達(dá)的相關(guān)性胃癌組織中CX43與mTOR及p70S6K蛋白的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.255，P<0.05；r=-0.273，P<0.05),mTOR與p70S6K蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.701，P<0.01)；CX43與mTOR及p70S6K mRNA的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.642，P<0.01；r=-0.678，P<0.01)，mTOR與p70S6K mRNA表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.630，P<0.01)。

表3 胃癌組織中CX43、mTOR及p70S6K蛋白表達(dá)(Western blot)與臨床病理特征的關(guān)系

表4 胃癌組織中CX43、mTOR及p70S6K mRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 討論

細(xì)胞間的通訊方式主要有間接通訊(如激素、生長(zhǎng)因子及第二信使等)和細(xì)胞連接(包括封閉連接、錨定連接和通訊連接)。其中有關(guān)通訊連接的研究較多，GJIC是由6個(gè)相同或相似的連接蛋白(connexin, CX)環(huán)繞而成一直徑約1.5 mm的親水性跨膜孔道，孔道在相鄰細(xì)胞各占一半，其通過(guò)相互滑動(dòng)的方式開(kāi)啟或關(guān)閉，使得相對(duì)分子質(zhì)量<1.0×104的小分子(如有機(jī)離子K+、Na+、Ca2+等)、第二信使(CGMP、CAMP等)及水溶性小分子量代謝物(如氨基酸、葡萄酸等)直接從一個(gè)細(xì)胞進(jìn)入到相鄰細(xì)胞，參與細(xì)胞正常的增殖與分化、細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的維持等過(guò)程。GJIC的功能下降或異常，可導(dǎo)致細(xì)胞增殖分化出現(xiàn)異常，促使腫瘤的形成。

目前發(fā)現(xiàn)的CX蛋白有21種，在胃組織中發(fā)現(xiàn)的類(lèi)型有CX6、CX32和CX43，其中CX43與腫瘤的關(guān)系最為密切，因此其成為研究的熱點(diǎn)。Li等[5]通過(guò)電鏡觀察到在胃癌組織中CX43介導(dǎo)的GJIC結(jié)構(gòu)遭到破壞，且隨著惡性程度的增加，破壞加重，由此推斷CX43介導(dǎo)的GJIC功能缺失或下降，可能是促癌變階段的重要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與正常胃黏膜組織相比，胃癌組織中CX43的表達(dá)明顯下降，且在低分化、TNM分期Ⅲ+Ⅳ期、浸潤(rùn)全層、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織中CX43的表達(dá)量低于高+中分化、臨床TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、浸潤(rùn)未達(dá)全層、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌組織，表明CX43表達(dá)減少或缺如參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。這與Tang等[6]的研究結(jié)果一致。趙宇等[7]研究發(fā)現(xiàn)CX43蛋白在肝細(xì)胞癌中的定位存在異常，其在正常細(xì)胞中均定位于細(xì)胞間相互接觸的細(xì)胞膜，在肝細(xì)胞癌中僅有極少量定位于胞膜，CX43表達(dá)多定位于細(xì)胞質(zhì)，表達(dá)程度的減弱及定位的改變最終導(dǎo)致細(xì)胞膜上有功能性的GJ形成下降，這可能是肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一。目前有研究通過(guò)一些手段預(yù)防或改變CX43在細(xì)胞膜上定位的恢復(fù)，或者上調(diào)CX43在細(xì)胞膜上的表達(dá)，使GJIC功能恢復(fù)，從而預(yù)防或抑制胃癌的進(jìn)展。如Liu等[8]的研究發(fā)現(xiàn)HP感染相關(guān)的胃癌中GATA-3可直接與啟動(dòng)子結(jié)合而抑制CX43的產(chǎn)生，使GATA-3沉默則可上調(diào)CX43的表達(dá)，從而抑制胃癌的進(jìn)展。張立偉等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌中抑制磷酸化的細(xì)胞骨架蛋白(p-Ezrin)能夠減少CX43的磷酸化，恢復(fù)GJIC功能，從而抑制腫瘤發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在胃癌及正常胃黏膜組織中CX43陽(yáng)性產(chǎn)物均位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，可能與抗體的選擇有關(guān)，在胃癌中是否也存在CX43定位的異常仍需進(jìn)一步探究。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶蛋白質(zhì)家族成員。p70S6K屬于mTOR下游底物之一。激活的mTOR能促進(jìn)p70S6K的磷酸化，磷酸化的p70S6K可以提高5′-TOR mRNA的翻譯效率，同時(shí)使p70S6K活性明顯增加，從而顯著增加蛋白質(zhì)的合成，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖，過(guò)度激活mTOR/p70S6K信號(hào)通路，能夠促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、血管形成、抑制細(xì)胞凋亡及自噬[10]。Liu等[11]和唐男等[12]研究發(fā)現(xiàn)，在膽囊癌、卵巢上皮性癌中mTOR和p70S6K異常激活，且兩者表達(dá)呈正相關(guān)，均與腫瘤分化程度、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)，與患者年齡、性別等無(wú)關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在胃癌組織中mTOR及p70S6K在基因及蛋白水平均存在過(guò)表達(dá)，并且隨著腫瘤惡性程度的增加、TNM分期越晚、浸潤(rùn)程度加深、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，胃癌組織中mTOR及p70S6K的表達(dá)量更多，其中p70S6K的表達(dá)量增加的尤為明顯，說(shuō)明在mTOR過(guò)度激活后刺激更多的p70S6K活化，導(dǎo)致胃癌細(xì)胞的過(guò)度增殖。綜上可見(jiàn)，mTOR在腫瘤組織中高表達(dá)，提示mTOR/p70S6K信號(hào)通路的特異性激活可能參與了腫瘤的發(fā)生、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移過(guò)程。mTOR/p70S6K信號(hào)通路在多種腫瘤中被異常激活，因此其處于該信號(hào)通路的核心地位，同時(shí)也是治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)。研究表明，雷帕霉素及其衍生物可以有效阻斷多種惡性腫瘤中mTOR和p70S6K的磷酸化，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。但從臨床試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析顯示[13-14]，在胃癌的抗mTOR單藥靶向藥物治療中，晚期胃癌患者的中位生存期及腫瘤控制率未顯示出該藥物的有效性?？赡苁且?yàn)槔着撩顾丶捌漕?lèi)似物通過(guò)負(fù)反饋引起Akt過(guò)度活化，減弱了其抗腫瘤作用，限制了單藥靶向治療的作用[15]。因此需要研究多點(diǎn)靶向聯(lián)合抑制劑，從而達(dá)到抑制胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。

Chen等[16]的研究結(jié)果表明，糖皮質(zhì)激素通過(guò)抑制Akt/mTOR信號(hào)通路抑制骨組織中CX43的表達(dá)，是糖皮質(zhì)激素引起骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制之一。Bi等[17]的研究發(fā)現(xiàn)在模擬糖尿病患者急性低血糖即高糖后低糖過(guò)程中，通過(guò)激活PI3K/Akt/mTOR和MEK/ERK1/2信號(hào)通路可下調(diào)H9c2心肌細(xì)胞CX43的表達(dá)。在胃癌中CX43是否直接或間接地通過(guò)與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路的相互作用參與調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程，目前未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CX43表達(dá)降低和mTOR/p70S6K信號(hào)通路的激活均與胃癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)。采用Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胃癌組織中CX43與mTOR、p70S6K蛋白及mRNA表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)。作者推測(cè)在胃癌中CX43表達(dá)下降，除了導(dǎo)致GJIC功能抑制或缺陷外，可能還通過(guò)與mTOR/p70S6K信號(hào)通路的相互作用參與調(diào)節(jié)胃癌的發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移過(guò)程，但具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探究。這一發(fā)現(xiàn)為研究胃癌發(fā)病機(jī)制及靶向治療提供了研究方向。