秦 雯，陳泰文，鄭海平，陶慧娟，朱小東

胰腺癌患者死亡的主要原因是早期癥狀不明顯，確診時(shí)癌細(xì)胞已向局部進(jìn)展或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)過(guò)最佳治療機(jī)會(huì)。因此，測(cè)定胰腺癌轉(zhuǎn)移的生物指標(biāo)，明確其轉(zhuǎn)移機(jī)制，是臨床制定合理的胰腺癌抗腫瘤治療方案、改善胰腺癌患者預(yù)后的研究熱點(diǎn)之一。目前認(rèn)為在癌癥背景下，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)可以驅(qū)動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移[1-2]、腫瘤復(fù)發(fā)[3]和腫瘤治療耐藥[4]。腫瘤發(fā)生EMT的同時(shí)往往伴隨其相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)的變化，如在子宮內(nèi)膜癌[5]、乳腺癌[6]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[7-8]、前列腺癌[9]、胃癌[10]、食管癌[11]、肺癌[12-13]等腫瘤中SOX4表達(dá)與EMT密切相關(guān)。此外，有研究推測(cè)在胰腺癌中，EMT可能催生了以E-cadherin下調(diào)、細(xì)胞骨架重組、運(yùn)動(dòng)和侵襲潛能為特征的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移表型，E-cadherin可能發(fā)揮著EMT軸標(biāo)志物的作用[14]。目前胰腺癌組織中SOX4、E-cadherin蛋白表達(dá)及其臨床意義尚不明確，兩者之間的關(guān)系也不明確。本實(shí)驗(yàn)采用組織芯片技術(shù)和免疫組化SP法檢測(cè)胰腺癌組織中SOX4和E-cadherin蛋白的表達(dá)，探討在胰腺癌發(fā)生和演進(jìn)過(guò)程中EMT的改變，以進(jìn)一步揭示胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年1月～2018年1月廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院、廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院收治的合計(jì)125例胰腺癌組織及對(duì)應(yīng)癌旁正常胰腺組織，其中癌旁組織距癌灶距離>2 cm。125例經(jīng)病理檢查證實(shí)均為胰腺導(dǎo)管腺癌，其中男性69例，女性56例，年齡(62.06±8.27)歲；患者術(shù)前均未接受任何輔助治療，其中病變位于胰頭者79例，位于胰體尾者46例；根據(jù)1997年國(guó)際抗癌聯(lián)盟(UICC)的病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：高、中、低分化胰腺導(dǎo)管腺癌分別為21、55、49例；腫瘤分期采用2018版美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)推出的胰腺癌分期系統(tǒng)：Ⅰ期23例，Ⅱ期50例，Ⅲ期38例，Ⅳ期14例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者62例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者63例。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 組織芯片構(gòu)建組織芯片制作實(shí)驗(yàn)在廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。依據(jù)HE染色切片選取相應(yīng)的組織蠟塊，鏡下觀察切片，并確定具有代表性的病變部位。制作組織芯片的取樣針直徑1.5 mm，組織芯間距1.0 mm，使用的儀器為組織芯片構(gòu)建儀(Beecher Instruments，Silver Spring, MD)。

1.3 免疫組化采用免疫組化SP法檢測(cè)SOX4及E-cadherin蛋白表達(dá)。兔抗人SOX4多克隆抗體和兔抗人E-cadherin多克隆抗體均購(gòu)自O(shè)rigene公司，SP免疫組化超敏試劑盒及DAB顯色劑均購(gòu)自福州邁新公司。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，具體操作步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定SOX4以細(xì)胞核(或細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì))出現(xiàn)彌漫均勻的淡黃色至棕褐色顆粒為陽(yáng)性，E-cadherin以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕褐色的線狀染色為陽(yáng)性。由兩名病理科醫(yī)師獨(dú)立完成閱片和判讀，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～2分為陰性，3～12分為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。SOX4及E-cadherin表達(dá)與胰腺癌臨床病理特征的相關(guān)性采用χ2檢驗(yàn)；SOX4與E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行生存分析；單因素及多因素生存分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌組織和癌旁組織中SOX4、E-cadherin蛋白的表達(dá)SOX4蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞核(或細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì))，呈彌漫均勻的淡黃色至棕褐色顆粒，E-cadherin蛋白表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜，呈淡黃色至棕褐色(圖1)。125例胰腺癌組織中97例(77.6%)SOX4蛋白陽(yáng)性，癌旁組織中15例(12.0%)SOX4蛋白陽(yáng)性；125例胰腺癌組織中18例(14.4%)E-cadherin蛋白陽(yáng)性，癌旁組織中103例(82.40%)E-cadherin蛋白陽(yáng)性。胰腺癌組織中，SOX4蛋白陽(yáng)性率高于癌旁組織，E-cadherin蛋白陽(yáng)性率低于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 胰腺癌組織及癌旁組織中SOX4及E-cadherin的表達(dá)[n(%)]

2.2 胰腺癌中SOX4、E-cadherin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系胰腺癌組織中，SOX4蛋白表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤部位、AJCC分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓和神經(jīng)侵犯相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤分化程度無(wú)關(guān)(P>0.05)。E-cadherin蛋白表達(dá)與腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤分化程度、AJCC分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓和神經(jīng)侵犯相關(guān)(P<0.05)，與患者性別、年齡無(wú)關(guān)(P>0.05，表2)。

表2 胰腺癌組織中SOX4、E-cadherin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

2.3 胰腺癌中SOX4和E-cadherin蛋白表達(dá)的相關(guān)性Spearman相關(guān)性分析顯示，SOX4和E-cadherin共同陽(yáng)性者1例，共同陰性者11例，SOX4陽(yáng)性而E-cadherin陰性者96例，SOX4陰性而E-cadherin陽(yáng)性者17例，兩者在胰腺癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.763，P<0.001，表3)。

表3 胰腺癌中SOX4和E-cadherin表達(dá)的相關(guān)性

2.4 SOX4和E-cadherin蛋白表達(dá)與胰腺癌患者生存期的相關(guān)性Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗(yàn)顯示，SOX4蛋白陽(yáng)性或E-cadherin蛋白陰性患者的生存期顯著縮短(P<0.001，圖2)。Cox單因素分析顯示，腫瘤大小、分化程度、AJCC分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓、神經(jīng)侵犯、SOX4蛋白表達(dá)及E-cadherin蛋白表達(dá)與患者生存期有關(guān)(P<0.05)；Cox多因素分析顯示，AJCC分期、腫瘤大小、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是影響患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素(表4、5)。

表4 胰腺癌患者的Cox單因素相關(guān)性分析

表5 胰腺癌患者的Cox多因素相關(guān)性分析

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析SOX4(A)、E-cadherin(B)

3 討論

1982年Greenburg和Hay[15]首次描述了EMT，指靜止的、極化的上皮細(xì)胞“轉(zhuǎn)化”為高度運(yùn)動(dòng)的、伸長(zhǎng)的間質(zhì)細(xì)胞能力；并初步描述了EMT在胚胎期神經(jīng)嵴、心內(nèi)膜墊形成過(guò)程中的功能，以及在成人組織傷口愈合和組織重塑過(guò)程中的功能。有趣的是，不恰當(dāng)?shù)刂匦录せ钆咛グl(fā)育過(guò)程和成人組織生長(zhǎng)過(guò)程的EMT，與人類惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。之后大量研究進(jìn)一步證實(shí)，EMT是上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性和細(xì)胞黏附而獲得間質(zhì)特征的過(guò)程，也是癌細(xì)胞獲得侵襲和遷移能力的首要環(huán)節(jié)[1-2]。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)，可能伴隨著其相關(guān)分子標(biāo)志物的表達(dá)變化[16]。在多種腫瘤中SOX4、E-cadherin蛋白表達(dá)與EMT密切相關(guān)[5-14]。

Sox(Sry-related high-mobility group box)轉(zhuǎn)錄因子家族成員幾乎存在于所有的細(xì)胞、組織和器官中，在細(xì)胞生長(zhǎng)和胚胎發(fā)育中發(fā)揮重要的功能。SOX4基因?qū)儆赟OX家族的C組成員，定位于6p22.3上，編碼一種由474個(gè)氨基酸組成的、主要定位于細(xì)胞核內(nèi)的蛋白質(zhì)，即SOX4蛋白。SOX4蛋白主要由N端HMG結(jié)構(gòu)域和C端轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transactivation domain,TAD)組成，可通過(guò)高度保守的HMG結(jié)構(gòu)域與DNA結(jié)合來(lái)激活或抑制靶基因的表達(dá)，也可與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用共同調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。SOX4在多種腫瘤中過(guò)表達(dá)，并能通過(guò)調(diào)節(jié)EMT促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。如在乳腺上皮細(xì)胞中SOX4參與了轉(zhuǎn)錄生長(zhǎng)因子β(transforming grows factor β, TGF-β)介導(dǎo)的EMT，敲除SOX4基因則能夠阻斷EMT[6]。

E-cadherin是一種經(jīng)典的鈣依賴性黏附分子家族成員，在正常組織和細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和形態(tài)學(xué)改變中發(fā)揮關(guān)鍵作用。E-cadherin蛋白促進(jìn)相鄰細(xì)胞間穩(wěn)定連接的形成，促進(jìn)上皮細(xì)胞黏附，并保持組織結(jié)構(gòu)和功能的完整性。此外，E-cadherin還能抑制腫瘤細(xì)胞分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)。因此，E-cadherin蛋白表達(dá)缺失降低了腫瘤細(xì)胞之間的相互黏附力，使其能夠突破細(xì)胞外基質(zhì)和基膜，脫離原發(fā)腫瘤，發(fā)生侵入和轉(zhuǎn)移。E-cadherin作為一種非常敏感的EMT標(biāo)志物，其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和未分化表型有關(guān)，與早期腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。E-cadherin表達(dá)下調(diào)被認(rèn)為是EMT過(guò)程中的關(guān)鍵事件[14]。

EMT也是胰腺癌早期侵襲和轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)選擇胰腺癌作為研究對(duì)象，對(duì)EMT相關(guān)蛋白SOX4和E-cadherin表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)和分析，結(jié)果顯示，SOX4在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，且腫瘤臨床分期越高、腫瘤體積越大，其SOX4表達(dá)越高；此外，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓或神經(jīng)侵犯者，其SOX4表達(dá)亦增高。E-cadherin在胰腺癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，且腫瘤臨床分期越高、腫瘤體積越大、腫瘤分化程度越低，其E-cadherin表達(dá)越低；此外，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管內(nèi)癌栓或神經(jīng)侵犯者，其E-cadherin表達(dá)也降低。這說(shuō)明胰腺癌的發(fā)生是漸進(jìn)的過(guò)程，SOX4和E-cadherin可能參與胰腺癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移，且兩者在胰腺癌組織中的變化趨勢(shì)相反。生存分析顯示，SOX4蛋白陰性組與陽(yáng)性組相比具有生存優(yōu)勢(shì)，生存期相對(duì)延長(zhǎng)；E-cadherin蛋白陽(yáng)性組與陰性組相比具有生存優(yōu)勢(shì)，生存期相對(duì)延長(zhǎng)。Cox單因素生存分析亦顯示，EMT相關(guān)蛋白SOX4及E-cadherin的表達(dá)與患者生存期有關(guān)。因此，有可能通過(guò)聯(lián)合檢測(cè)SOX4及E-cadherin表達(dá)來(lái)判斷胰腺癌的預(yù)后。此外，EMT過(guò)程具有可塑性，可通過(guò)誘導(dǎo)間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal-epithelial transition, MET)來(lái)逆轉(zhuǎn)。因此，增強(qiáng)對(duì)EMT如何啟動(dòng)和逆轉(zhuǎn)，以及如何調(diào)控的認(rèn)識(shí)，對(duì)于降低腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的病死率至關(guān)重要。

綜上所述，利用組織芯片和免疫組化法檢測(cè)胰腺癌組織中EMT相關(guān)蛋白SOX4及E-cadherin的表達(dá)，不僅為進(jìn)一步揭示胰腺癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制及患者預(yù)后判斷提供參考依據(jù)，而且在調(diào)控和逆轉(zhuǎn)EMT、預(yù)防和治療胰腺癌方面也具有重要的臨床指導(dǎo)意義。