于 博，劉 穎,2，徐 然,2，白麗娜,2，馮麟媛,2，楊 洋,2

結(jié)腸癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率及病死率均較高[1-2]。近年，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率和病死率均呈上升趨勢(shì)，且超過60%的患者在確診時(shí)已為晚期，5年生存率不足13%，預(yù)后差[3-4]。因此，臨床亟待尋找結(jié)腸癌的早期識(shí)別及預(yù)后評(píng)估的生物學(xué)標(biāo)志物，以提升患者的早期診斷率，延長患者的生存期。NCAPD2從屬于染色體凝縮蛋白復(fù)合物I，是非SMC亞單位的亞基之一，主要參與染色質(zhì)有絲分裂的正常分離和凝縮過程[5]。已有多項(xiàng)研究顯示，凝縮蛋白復(fù)合物亞基的功能異常缺失/獲得參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展。其中，在SMC亞單位中SMC2基因的異常改變可能與胃癌和結(jié)直腸癌的發(fā)生密切相關(guān)[6]；其同屬的SMC4基因也在結(jié)直腸癌和肝癌中與細(xì)胞周期進(jìn)程密切相關(guān)[7]；同樣非SMC亞單位NCAPH在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)，并可作為一種預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物[8]。目前，尚無文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)NCAPD2與結(jié)腸癌患者預(yù)后之間的關(guān)系。本文采用免疫組化SP法檢測(cè)NCAPD2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征、預(yù)后評(píng)估之間的關(guān)系，探討NCAPD2蛋白對(duì)結(jié)腸癌患者預(yù)后的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料組織芯片購自上海芯超生物公司，組織芯片標(biāo)本180例，其中包括86例癌旁正常組織和94例結(jié)腸癌組織。94例結(jié)腸癌患者男性48例，女性46例；年齡范圍27～90歲；腫瘤直徑：≤4 cm者34例，>4 cm者60例；病理分級(jí)：Ⅰ級(jí)19例，Ⅱ級(jí)60例，Ⅲ級(jí)15例；T分期：T1+T2者11例，T3+T4者83例；臨床分期：Ⅰ+Ⅱ期58例，Ⅲ+Ⅳ期36例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者34例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者60例。

1.2 主要試劑NCAPD2兔抗人單克隆抗體購自美國Abcam公司，免疫組化SP兩步法試劑盒購于北京中杉金橋公司。

1.3 免疫組化標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，行免疫組化SP兩步法染色。其中，免疫組化染色步驟參照本組前期實(shí)驗(yàn)[9]，主要包括：組織切片常規(guī)烤片脫蠟水化抗原熱修復(fù)，滴加一抗4 ℃孵育過夜后滴加二抗孵育45 min，DAB顯色，蘇木精對(duì)比染色，中性樹膠封固。選擇NCAPD2蛋白強(qiáng)陽性染色的切片作為陽性對(duì)照，選擇以PBS代替一抗的染色結(jié)果作為陰性對(duì)照。

1.4 評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)Beesley分級(jí)法，以細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中出現(xiàn)棕褐色顆粒的比例作為判定NCAPD2蛋白陽性染色的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)占0～5%為(-)，6%～25%為(+)，26%～50%為()，51%～75%為()。其中“+～”為陽性，“”為強(qiáng)陽性。

1.5 生信分析采用TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)檢索NCAPD2基因在多種腫瘤中的差異表達(dá)；應(yīng)用UALCAN數(shù)據(jù)庫(http://ualcan.path.uab.edu/index.html)分析結(jié)腸癌組織和正常黏膜組織中NCAPD2 mRNA的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系；應(yīng)用GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles/)分析在正常結(jié)腸黏膜組織、結(jié)腸癌組織和轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中NCAPD2 mRNA的表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 25.0和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)法分析NCAPD2表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性；采用t檢驗(yàn)分析NCAPD2 mRNA表達(dá)與腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系；采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析；Cox回歸模型進(jìn)行單因素和多因素預(yù)后分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌組織中NCAPD2 mRNA的表達(dá)通過TIMER數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)現(xiàn)，NCAPD2基因在多種惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，其在結(jié)腸癌組織中mRNA表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織(P<0.01，圖1A)；GEO和UALCAN數(shù)據(jù)庫分析顯示，與癌旁正常組織相比，結(jié)腸癌組織中NCAPD2 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01，圖1B、C)。進(jìn)一步分析NCAPD2 mRNA的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)其與結(jié)腸癌臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)：在不同分期的結(jié)腸癌組織中NCAPD2的表達(dá)水平均顯著高于癌旁正常組織(圖2A)；且結(jié)腸癌無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0)和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N1～N2)組織中NCAPD2 mRNA表達(dá)水平均高于癌旁正常組織(P<0.05，圖2B)。此外，GEO數(shù)據(jù)庫分析顯示，與結(jié)腸癌組織相比，NCAPD2 mRNA在轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中的表達(dá)水平亦顯著升高(P<0.01，圖2C);提示NCAPD2與結(jié)腸癌的惡性演進(jìn)密切相關(guān)。

圖1 NCAPD2 mRNA在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)：TIMER(A)數(shù)據(jù)庫分析各種腫瘤組織中NCAPD2 mRNA表達(dá)；GEO(B)和UALCAN(C)數(shù)據(jù)庫分析不同結(jié)腸組織中NCAPD2 mRNA的表達(dá)

圖2 NCAPD2 mRNA在不同結(jié)腸癌組織中的表達(dá)差異：UALCAN數(shù)據(jù)庫中NCAPD2 mRNA表達(dá)水平與結(jié)腸癌臨床分期(A)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(B)的關(guān)系；C.GEO數(shù)據(jù)庫原發(fā)及轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌組織中NCAPD2 mRNA的表達(dá)

2.2 結(jié)腸癌組織中NCAPD2蛋白表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，NCAPD2蛋白在結(jié)腸良性病變組織中呈陰性，在結(jié)腸癌組織中呈陽性，且主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖3)。在結(jié)腸癌組織中，NCAPD2蛋白陽性率和強(qiáng)陽性率分別為89.36%(84/94)和75.53%(71/94)；在癌旁正常結(jié)腸組織中NCAPD2蛋白陽性率和強(qiáng)陽性率分別為34.88%(30/86)和19.77%(17/86)。在結(jié)腸癌組織中NCAPD2蛋白陽性率和強(qiáng)陽性率均顯著高于癌旁正常結(jié)腸組織，差異有顯著性(P<0.01)，提示NCAPD2蛋白在結(jié)腸癌組織中表達(dá)上調(diào)。

圖3 NCAPD2蛋白在癌旁正常結(jié)腸組織中呈陰性(A)，在結(jié)腸癌組織中呈弱陽性(B)、陽性(C)、強(qiáng)陽性(D)，SP兩步法

2.3 NCAPD2蛋白過表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)一步對(duì)NCAPD2蛋白過表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，NCAPD2蛋白表達(dá)水平與結(jié)腸癌患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度及T分期無關(guān)，與臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05，表1)。其中，NCAPD2蛋白在結(jié)腸癌晚期(Ⅲ+Ⅳ)組織中的強(qiáng)陽性率(88.9%，32/36)明顯高于早期(Ⅰ+Ⅱ)組織(67.2%，39/58，P=0.004，圖4A)；在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中的強(qiáng)陽性率(88.2%，30/34)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(68.3%，41/60，P=0.031，圖4B)。

表1 結(jié)腸癌組織中NCAPD2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

圖4 NCAPD2蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系：

2.4 生存分析Kaplan-Meier生存分析顯示，NCAPD2蛋白高表達(dá)的結(jié)腸癌患者總生存期明顯低于NCAPD2蛋白低表達(dá)患者(Log-rank=5.602，P=0.018，圖5A)；且NCAPD2蛋白高表達(dá)的T3+T4分期結(jié)腸癌患者總生存期亦明顯低于NCAPD2蛋白低表達(dá)患者(Log-rank=7.803，P=0.005，圖5B)。Cox單因素分析結(jié)果顯示，NCAPD2表達(dá)、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均是影響結(jié)腸癌患者生存期的風(fēng)險(xiǎn)因素(P均<0.05，圖6A)。Cox多因素分析顯示，NCAPD2表達(dá)與臨床分期均是影響患者結(jié)腸癌生存期的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素(P<0.05，圖6B)；提示NCAPD2蛋白可作為結(jié)腸癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。

圖5 NCAPD2蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后的相關(guān)性：

圖6 Cox分析影響結(jié)腸癌患者預(yù)后的因素：

3 討論

結(jié)腸癌是全球癌癥死亡的主要原因之一，早期結(jié)腸癌患者的生存率高達(dá)90%，但早期診斷存在局限性，致使結(jié)腸癌患者早期診斷率不足40%[10]。

近年隨著對(duì)結(jié)腸癌分子生物學(xué)特性及發(fā)病機(jī)制的深入分析，已有生物學(xué)標(biāo)志物用于結(jié)腸癌的早期診斷及預(yù)后監(jiān)測(cè)，如CEA、CA19-9和CA12-5等，但在癌前病變和臨床早期中的診斷敏感性和特異性低[11]。羅志飛等[12]研究結(jié)果顯示，不同基因的異常表達(dá)可通過影響細(xì)胞周期的紊亂促進(jìn)結(jié)腸癌的演進(jìn)。朱劍軍等[13]在結(jié)腸癌中的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期的紊亂可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖。因此，從分子生物學(xué)水平闡明結(jié)腸癌的分子機(jī)制，尋找潛在的分子標(biāo)志物具有非常重要的臨床意義。

染色體凝縮蛋白復(fù)合物是一種多蛋白復(fù)合物，其包含凝縮蛋白復(fù)合物Ⅰ和Ⅱ，前者主要定位于細(xì)胞質(zhì)，后者則定位于細(xì)胞核。其中，凝縮蛋白復(fù)合物Ⅰ由SMC亞單位和非SMC亞單位組成，SMC亞單位包括SMC2和SMC4，非SMC亞單位包括NCAPH、NCAPD2、NCAPG三種亞基。有研究顯示，染色體凝縮蛋白復(fù)合物Ⅰ的亞基之一的NCAPD2的缺失可縮短有絲分裂前中期染色體的長度，延長細(xì)胞分裂的前中期及后期[14-15]。此外，NCAPD2上的HEAT重復(fù)組成的一個(gè)串聯(lián)排列的雙螺旋結(jié)構(gòu)，可在蛋白質(zhì)之間的相互作用中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[16]。同時(shí)，其作為細(xì)胞周期調(diào)控因子酪蛋白激酶2的作用靶點(diǎn)，與細(xì)胞退化、DNA損傷位點(diǎn)識(shí)別等生物學(xué)功能密切相關(guān)[16-17]。雖然科研界對(duì)于NCAPD2的生物學(xué)功能有所了解，但對(duì)于NCAPD2與人類疾病，尤其是腫瘤間的相關(guān)報(bào)道較少。近年研究結(jié)果證實(shí)，NCAPD2基因多態(tài)性參與中國漢族人帕金森的發(fā)病過程[18]；NCAPD2在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中表達(dá)上調(diào)，并預(yù)示患者的不良預(yù)后[19]。Zhang等[20]研究結(jié)果亦證實(shí)了凝縮素蛋白復(fù)合物的表達(dá)水平可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，并且可作為肝癌患者不良預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。但尚無研究明確NCAPD2表達(dá)與結(jié)腸癌之間的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NCAPD2 mRNA表達(dá)水平在結(jié)腸癌組織中顯著升高，其表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系密切(P<0.05)。免疫組化結(jié)果與之一致，NCAPD2蛋白在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)；提示NCAPD2與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展存在一定的相關(guān)性。進(jìn)一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，NCAPD2蛋白高表達(dá)與結(jié)腸癌臨床分期(P=0.001)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.047)呈顯著正相關(guān)；揭示NCAPD2作為癌基因在結(jié)腸癌的惡性演進(jìn)中發(fā)揮重要作用。此外，Kaplan-Meier生存曲線分析、Cox回歸模型顯示，NCAPD2蛋白高表達(dá)的結(jié)腸癌患者的生存期顯著低于NCAPD2蛋白低表達(dá)患者，且NCAPD2蛋白表達(dá)水平是結(jié)腸癌患者獨(dú)立的預(yù)后不良因素；提示NCAPD2蛋白是判斷結(jié)腸癌不良預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。

綜上所述，NCAPD2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)存在不同程度的升高，其高表達(dá)狀態(tài)可預(yù)示結(jié)腸癌較強(qiáng)的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能和不良預(yù)后，對(duì)結(jié)腸癌患者的早期診斷和預(yù)后評(píng)估具有一定的臨床指導(dǎo)意義。