權(quán)秋穎，曹 磊，張 閩，黃 山，黃仁鵬，陳 志，郭凌川

胃癌是起源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤，發(fā)病率位居全球惡性腫瘤的第5位，病死率位居癌癥死亡的第3位[1]。每年中國(guó)胃癌患者的死亡人數(shù)約占全球胃癌死亡人數(shù)的一半[2]。傳統(tǒng)治療如手術(shù)和放、化療均無(wú)法明顯改善患者的總生存期，5年生存率不足30%[1]。程序性細(xì)胞死亡配體1(programmed cell death ligand 1, PD-L1)作為負(fù)性共刺激分子，是B7家族的一員，其與對(duì)應(yīng)的配體PD-1結(jié)合可造成T細(xì)胞失活[3-4]。PD-L1在多種腫瘤如胃癌、黑色素瘤、肺癌、結(jié)直腸癌等[5]中過(guò)表達(dá)。在很多實(shí)體腫瘤如黑色素瘤、肺癌中，抗PD-L1抑制劑表現(xiàn)出了良好的效果[6]，但在胃癌中，采用抗PD-L1抑制劑總體有效率不高。研究表明，腫瘤組織中PD-L1表達(dá)、腫瘤間質(zhì)中浸潤(rùn)細(xì)胞的類(lèi)型等均與患者采取抗PD-L1治療后的效果有關(guān)[7]，因此選擇適宜行免疫治療的人群至關(guān)重要。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages, TAMs)在免疫微環(huán)境中扮演著重要的角色，TAMs可分為M1型和M2型，其中M1型主要發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)，M2型(因表達(dá)特異性標(biāo)志物CD163，以下均用CD163表示)通過(guò)產(chǎn)生免疫抑制細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，同時(shí)還可表達(dá)PD-L1/2，與T細(xì)胞結(jié)合產(chǎn)生免疫抑制作用[8-9]。一般狹義的TAMs即指發(fā)揮免疫抑制及促瘤作用的M2型TAMs。然而，PD-L1和M2型TAMs的關(guān)系仍需深入探討。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察PD-L1和CD163在胃腺癌組織中的表達(dá)，旨在為胃癌聯(lián)合治療提供新思路和方向。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2011年5～12月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院存檔的268例胃腺癌標(biāo)本，所有標(biāo)本術(shù)前均經(jīng)病理確診，患者年齡33～88歲，平均(64.5±10.8)歲。所有患者術(shù)前均未行任何放、化療等其它治療。通過(guò)電話隨訪獲得患者的生存狀況，隨訪截至2017年12月，合計(jì)198例患者獲得完整的生存資料，余70例失訪。

1.2 主要儀器及試劑大體顯微鏡(CX23)，購(gòu)自日本Olympus公司，Dmetrix遠(yuǎn)程醫(yī)療圖像處理系統(tǒng)，購(gòu)自帝麥克斯蘇州醫(yī)療公司，全自動(dòng)多功能染色機(jī)(ST5020)，購(gòu)自徠卡公司。PD-L1(克隆號(hào)SP142)、CD163(克隆號(hào)10D6)，均購(gòu)自北京中杉金橋公司，免疫組化用二抗HRP標(biāo)記鼠/兔通用型二抗，購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 方法采用免疫組化EnVision法檢測(cè)胃腺癌癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中PD-L1蛋白表達(dá)水平及CD163在胃腺癌間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)，分析兩者表達(dá)與胃腺癌臨床病理特征及患者預(yù)后的相關(guān)性。評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)：所有切片均經(jīng)兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師采用雙盲法閱片，對(duì)腫瘤細(xì)胞及腫瘤間質(zhì)區(qū)域分別進(jìn)行評(píng)分，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率為陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù)/所有視野內(nèi)細(xì)胞總數(shù)×100。切片染色評(píng)分為0～3分(無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分)，將評(píng)分0～1分歸為低表達(dá)組，2～3分歸為高表達(dá)組；根據(jù)公式計(jì)算染色定量的組織評(píng)分(3+陽(yáng)性細(xì)胞百分率)×3+(2+陽(yáng)性細(xì)胞百分率)×2+(1+陽(yáng)性細(xì)胞百分率)×1，免疫組化評(píng)分范圍從0～300不等[10]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用χ2檢驗(yàn)分析PD-L1和CD163蛋白表達(dá)與胃腺癌臨床病理特征之間的關(guān)系，Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)分析PD-L1與CD163在胃腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性，采用Kaplan-Meier生存曲線和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行預(yù)后生存分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃腺癌組織中PD-L1和CD163的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系52例(19.4%)胃腺癌癌細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，167例(62.3%)胃腺癌間質(zhì)細(xì)胞高表達(dá)PD-L1，PD-L1和CD163表達(dá)均可定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)(圖1)。胃腺癌間質(zhì)細(xì)胞中PD-L1表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度(P=0.010)、腫瘤分期(P=0.043)呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)；胃腺癌癌細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)與各臨床病理特征均無(wú)關(guān)；CD163表達(dá)與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期呈正相關(guān)(P<0.05，表1)。

圖1 胃腺癌組織中PD-L1和CD163的表達(dá)：

表1 胃腺癌組織中PD-L1和CD163的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.2 胃腺癌組織中PD-L1與CD163表達(dá)的相關(guān)性相關(guān)性分析結(jié)果顯示，胃腺癌癌細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)與CD163表達(dá)均呈正相關(guān)(P<0.001，圖2)。

圖2 胃腺癌組織中PD-L1與CD163蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析：

2.3 生存分析Kaplan-Meier生存曲線分析顯示，胃腺癌癌細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)與患者生存無(wú)相關(guān)性(圖3A)；胃腺癌間質(zhì)細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)越高，患者預(yù)后越好(P=0.028，圖3B)；CD163表達(dá)與患者生存無(wú)關(guān)(圖3C)。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線分析：

2.4 聯(lián)合檢測(cè)PD-L1與CD163的表達(dá)與胃腺癌患者預(yù)后的關(guān)系胃腺癌癌細(xì)胞或間質(zhì)細(xì)胞中PD-L1高表達(dá)同時(shí)CD163低表達(dá)時(shí)患者預(yù)后最佳，PD-L1低表達(dá)同時(shí)CD163高表達(dá)時(shí)患者預(yù)后最差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖4 PD-L1和CD163聯(lián)合檢測(cè)與胃腺癌患者的預(yù)后分析：

3 討論

既往報(bào)道表明，通過(guò)靶向PD-1或PD-L1的單克隆抗體在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的治療中起到了令人矚目的效果，然而，其在胃癌中的療效仍未有明確定論，PD-L1在胃癌組織中的表達(dá)及與患者預(yù)后的關(guān)系仍有爭(zhēng)議，其調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步探討[11]。TAMs在促進(jìn)腫瘤增殖、新生血管形成和轉(zhuǎn)移中扮演重要角色，TAMs還可表達(dá)PD-L1/2，與PD-1結(jié)合從而抑制T細(xì)胞的激活。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PD-L1在胃腺癌癌細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)均與CD163表達(dá)呈正相關(guān)，表明通過(guò)分析PD-L1表達(dá)與CD163表達(dá)之間的相關(guān)性可進(jìn)一步預(yù)測(cè)患者預(yù)后，并對(duì)抗PD-1/PD-L1免疫卡控點(diǎn)抑制劑的應(yīng)用提供潛在研究基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PD-L1在胃腺癌間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)越高，患者預(yù)后越好，并與腫瘤浸潤(rùn)深度及腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)；胃腺癌癌細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)與患者預(yù)后無(wú)關(guān)。既往研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1高表達(dá)患者，生存期較短，預(yù)后較差[12-13]；相反，同樣有研究表明PD-L1陽(yáng)性患者預(yù)后較好[14]；對(duì)早期胃癌進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在PD-L1高表達(dá)的病例中更易觀察到血管和淋巴管的侵犯[15]；而最近的一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果表明，在胃癌的治療中，抗PD-1/PD-L1單克隆抗體被認(rèn)為是一種具有前景的免疫療法[11]。因此，PD-L1表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系存在爭(zhēng)議，PD-L1在胃癌組織中的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系尚需更多研究進(jìn)行深入探究。

TAMs可分泌多種細(xì)胞因子，抑制效應(yīng)T細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展，在實(shí)體腫瘤中，TAMs的表達(dá)高低可影響患者預(yù)后。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CD163的表達(dá)與患者預(yù)后無(wú)關(guān)，但與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤分期呈正相關(guān)。然而，腫瘤組織中PD-L1和TAMs的關(guān)系仍未闡明，在對(duì)乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，乳腺癌細(xì)胞可分泌促使M1型TAMs向M2型TAMs轉(zhuǎn)化的細(xì)胞因子，并且CD163+M2型TAMs數(shù)目越多，腫瘤分化越差，增殖更快[16]。在非小細(xì)胞肺癌中，M2型TAMs的浸潤(rùn)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期及更差的無(wú)瘤生存期和總生存期相關(guān)[17]；另外，有研究發(fā)現(xiàn)TAMs在結(jié)直腸癌中可通過(guò)產(chǎn)生IL-1、IL-6和TNF-α等細(xì)胞因子激活NF-κB，從而分泌VEGF促進(jìn)腫瘤血管生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[9]。同時(shí)有研究表明，TAMs可通過(guò)JAK/STAT3和PI3K/ALK通路促進(jìn)PD-L1的表達(dá)[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD163的表達(dá)與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)，亦發(fā)現(xiàn)PD-L1高表達(dá)同時(shí)CD163低表達(dá)的患者預(yù)后最佳，而PD-L1低表達(dá)同時(shí)CD163高表達(dá)的患者預(yù)后最差，這些結(jié)果表明，聯(lián)合評(píng)估PD-L1和CD163的表達(dá)可更好的評(píng)估患者的預(yù)后特征，為抗PD-1/PD-L1單克隆抗體的應(yīng)用篩選合適的患者人群提供新思路，同時(shí)也為胃癌的免疫治療提供了新的視角和方向。

采用免疫卡控點(diǎn)抑制劑的治療方法如抗PD-1/PD-L1的單克隆抗體正在越來(lái)越多的癌種中使用，而TAMs通過(guò)表達(dá)PD-L1/2成為靶向免疫檢查點(diǎn)治療的重要組成部分，在一些細(xì)胞因子或缺氧條件的刺激下，巨噬細(xì)胞中的PD-L1/L2表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和進(jìn)展[19]。也有研究表明，TAMs可以促進(jìn)胃癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[20]。值得注意的是，TAMs具有明顯的異質(zhì)性，且可塑性較強(qiáng)[21]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制髓系生長(zhǎng)因子受體CSF1R的信號(hào)通路，可以增加巨噬細(xì)胞提呈抗原和抗腫瘤的能力，同時(shí)聯(lián)合PD-1或CTLA-4拮抗劑可更好的誘導(dǎo)腫瘤消退[22]。這些結(jié)果表明通過(guò)靶向TAMs的治療策略可能會(huì)減少PD-L1在腫瘤組織中的表達(dá)，從而激活效應(yīng)T細(xì)胞，進(jìn)而增強(qiáng)抗PD-1/PD-L1阻斷劑的效果。

綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，胃腺癌組織中CD163表達(dá)與PD-L1表達(dá)呈正相關(guān)，表明通過(guò)阻斷TAMs的激活通路，同時(shí)聯(lián)合免疫卡控點(diǎn)療法如PD-L1單克隆抗體在胃癌的免疫治療或許能起到更好的效果。