劉超，張焱祥，王顯勛，李勇光

(江漢大學附屬湖北省第三人民醫(yī)院 骨科,湖北 武漢 430000)

近年來，各種骨折的發(fā)生率明顯增加，其中肢體骨折是骨折的主要類型[1]。骨折的治療包括手術治療和非手術治療,為了獲得更好的治療效果，臨床上通常采用外固定、切除內(nèi)固定、髓內(nèi)釘固定等方法[2]，但術后骨的發(fā)育和生長也是康復的重要因素。骨的發(fā)育和形成主要通過軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨，而肢體骨的發(fā)育和形成主要通過軟骨內(nèi)成骨[3]，既往研究發(fā)現(xiàn)軟骨內(nèi)成骨過程與各種內(nèi)分泌激素及相關生長因子的調(diào)控有關，這些內(nèi)分泌激素及相關生長因子通過復雜的相互作用和一系列正、負反饋來調(diào)控骨骼的發(fā)生和生長[4]。印度刺猬蛋白(Ihh)是Hedgehog家族成員之一，在所有生物系統(tǒng)中都能檢測到其表達，在生物發(fā)育過程中起著復雜而重要的作用，是臨床調(diào)節(jié)軟骨細胞分化和增殖的信號因子[5]。本研究旨在分析Ihh基因敲除對小鼠腓骨骨折愈合的影響，為Ihh信號通路抑制劑治療骨折患者提供實驗和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 40只同時存在基因型Ⅱ型膠原(Col2)a1-哺乳動物細胞Cre重組酶表達質(zhì)粒(Cre ERT2)的 Ihhf1/f1小鼠，12周齡，體質(zhì)量(23.42±2.25)g，購于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2020-0015。所有小鼠均給予常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進食、飲水，本研究動物實驗符合復旦大學科學部實驗動物倫理學標準。

1.1.2主要試劑與儀器 超凈工作臺(濟南鑫貝西生物技術有限公司)、低速離心機(山東博科集團)、倒置顯微鏡(MOTIC)、倒置熒光顯微鏡(型號DMI6000B,Leica)、臺式高速離心機(上海安亭科學儀器廠)、Micro-CT(Skyscan1176)、凝膠成像及分析系統(tǒng)(南京世研儀器)。胎牛血清(上海李記生物科技有限公司)、DMEM-高糖培養(yǎng)基(上海聯(lián)碩生物科技有限公司)、青—鏈霉素、PBS緩沖液、Lipofectamine 2000 (北京宜科思源科技有限公司)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1實驗期間小鼠情況 小鼠常規(guī)飼養(yǎng)至12周齡，飼養(yǎng)過程中2組小鼠中各有1只死亡；12周齡時對剩余38只小鼠實施無菌條件下后肢腓骨骨折造模，經(jīng)腓骨X線正側位片觀察存在明顯的骨折線即診斷為造模成功；2組中又各有1只小鼠造模后腓骨X線正側位片不合格，被剔除實驗，最終成功造模36只，觀察組和對照組各18只。

1.2.2實驗分組 采用Ihhf1/f1和Col2a1-CreERT2；Ihhf1/f1基因型小鼠繁育，采用PCR凝膠電泳技術鑒定新生小鼠的基因型，從新生小鼠中隨機選取Col2a1-CreERT2、Ihhf1/f1基因型小鼠40只。隨機選取20小鼠作為觀察組，出生后第1、2天腹腔注射雌激素受體拮抗劑TM(托馬西酚)溶液，誘導IHH基因敲除[6]；其余20只小鼠腹腔注射等量植物油作為對照組。

1.2.3腓骨骨折模型制備 小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(劑量40 mg/kg)麻醉，仰臥并固定在手術臺上，常規(guī)脫毛、皮膚準備和碘伏消毒，后肢腓骨中段用線鋸水平切開，將直徑為1.0 mm的克氏針逆行引入近端骨折，穿過腓骨大轉子上部，骨折復位后順行引入遠端髓腔；用生理鹽水沖洗傷口，分層密封。每只小鼠注射50 000 U的青霉素以防止感染，醒后恢復進食和自由活動。

1.3 觀察指標

造模后第1周、第2周及第3周末2組各取6只小鼠：(1)斷頭法處死小鼠，取腓骨，使用4%中性甲醛固定72 h行X線檢查，由3名實驗員共同討論評價骨折線模糊程度；(2)腓骨樣本固定72 h后行Micro-CT掃描，電壓42 kV、電流555 μA、角度360°、濾過片0.2 mm、分辨率8.73 μm，行骨痂三維圖像重建分析各項參數(shù)；(3)處死小鼠前，抽取1 mL鼠尾靜脈血，室溫下靜置1 h，以2 500 r/min的速率離心15 min，取上層血清，采用ELISA法檢測血清血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子(TGF-β1)、堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)、鈣與磷離子濃度，計算鈣磷乘積，采用對硝基苯磷酸鹽法測定ALP活性;(4)ABH染色，取腓骨樣本10%中性甲醛固定72 h，以10%中性EDTA脫鈣4周，然后脫水、包埋、制成蠟塊，切為3 μm組織切片，56 ℃烤片過夜，行ABH染色，中性樹脂封片，觀察結果。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS 23.0分析。計量數(shù)據(jù)行重復測量方差分析與LSD-t檢驗，計數(shù)資料比較為秩和檢驗，α=0.05，Bonferroni校正法調(diào)整檢驗水準。

2 結果

2.1 X線顯示骨折線

造模后3個時點2組小鼠腓骨側位X線片可見，隨著造模時間的延長各組小鼠的骨折線均逐漸模糊，造模后第1周2組小鼠均有清晰骨折線及不明顯骨性連接影；造模后第2周2組小鼠均有模糊骨折線，且骨性骨痂連接影增多；造模后第3周2組小鼠骨折線均模糊，且觀察組骨折線模糊和非常模糊的比例低于對照組(P<0.05)。見表1和圖1。

表1 造模后不同時點2組小鼠骨折線模糊程度Tab.1 Comparison of the ambiguity of fracture lines between 2 groups at different times after modeling

2.2 骨折部位Micro-CT參數(shù)

隨著造模骨折時間的延長，各組小鼠Micro-CT參數(shù)中SMI逐漸降低，TV、BV、BV/TV、Tb.N、Tb.Th先升高后降低，Tb.Pf逐漸降低。與對照組相比，觀察組小鼠造模后第2周和第3周時Micro-CT參數(shù)中SMI、TV、BV、BV/TV、Tb.N水平均降低，Tb.Pf、Tb.Th水平均升高(P<0.05)。見表2。

注：箭頭指向為骨折線。圖1 造模后不同時點2組小鼠腓骨骨折線(側位)Fig.1 The fracture lines between 2 groups at different times after modeling (lateral position)

表2 2組小鼠造模后不同時點骨折部位Micro-CT參數(shù)Tab.2 Comparison of Micro-CT parameters between 2 groups at different times after modeling

2.3 血清VEGF、TGF-β1、ALP、BGP水平

隨著造模時間的延長，對照組小鼠血清VEGF水平逐漸降低，TGF-β1水平先升高后降低，ALP、BGP水平逐漸升高，觀察組小鼠血清VEGF水平逐漸降低，TGF-β1水平先升高后降低，ALP水平逐漸降低，BGP水平先降低后升高。與對照組相比，造模后第1周時觀察組小鼠的血清VEGF水平降低，造模后第2周、第3周時小鼠的血清VEGF、TGF-β1、ALP、BGP水平均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組小鼠造模后不同時點血清VEGF、TGF-β1、ALP及BGP水平Tab.3 Comparison of serum VEGF,TGF-β1,ALP,and BGP levels between 2 groups at different times after modeling

2.4 血清鈣、磷離子濃度及鈣磷乘積

隨著造模時間的延長，對照組小鼠血清鈣離子水平逐漸降低，磷離子水平先降低后升高，鈣磷乘積逐漸升高，觀察組小鼠血清鈣離子水平逐漸降低，磷離子、鈣磷乘積水平逐漸升高。與對照組比較，造模后第2周和第3周時觀察組小鼠的血清鈣離子濃度均升高、血清磷離子均降低(P<0.05)。見表4。

表4 2組小鼠造模后不同時點血清鈣、磷離子濃度及鈣磷乘積比較Tab.4 Comparison of serum calcium,phosphorus ion concentrations,and calcium and phosphorus product between 2 groups at different times after modeling

2.5 ABH染色

ABH染色結果顯示，造模后第1周2組小鼠骨痂可見較多軟骨成分；造模后第2周2組小鼠軟骨成分相似，對照組出現(xiàn)骨性骨痂；與造模后第1周和第2周比較，造模后3周觀察組小鼠僅出現(xiàn)少量骨性骨痂，骨小梁小于于對照組，且形狀不規(guī)則，而對照組的骨小梁形狀較觀察組規(guī)則、粗大。見圖2。

注：A、C、E分別為對照組第1周、第2周和第3周，B、D、F分別為觀察組第1周、第2周和第3周；綠色箭頭(黑色部位)為肌肉，紅色箭頭(白色部位)為骨骼。圖2 造模后不同時點2組小鼠ABH染色情況(50×)Fig.2 ABH staining between 2 groups at different times after modeling(50×)

3 討論

骨折患者臨床治療中骨組織的形成是康復的重要過程，骨組織的形成是通過不同細胞高度協(xié)調(diào)的過程，而四肢骨發(fā)生的主要形式為軟骨內(nèi)成骨，該過程內(nèi)包括間葉細胞群形成軟骨原基，軟骨細胞的增殖、分化、成熟，血管侵入，成骨細胞和破骨細胞出現(xiàn)，礦化幾個過程[7-8]。已有研究表明，Ihh信號通路與骨性關節(jié)炎和腫瘤的發(fā)生密切相關，且Ihh信號通路在軟骨內(nèi)成骨以及骨的生長中也很重要[9-10]。隨著人口老齡化的加劇，老年人群骨性關節(jié)炎或腫瘤的發(fā)生率增高，易發(fā)生骨折[11]。本研究分析了Ihh基因敲除對腓骨骨折小鼠愈合的影響，以期為今后當患有骨性關節(jié)炎或腫瘤患者出現(xiàn)骨折時，通過Ihh信號通路抑制劑來干預骨折愈合，從而開辟新的治療途徑，獲得更佳的臨床療效。

已有研究指出，Ihh可調(diào)節(jié)軟骨細胞的增殖和肥大，調(diào)節(jié)軟骨內(nèi)骨的形態(tài)發(fā)生，它的作用非常復雜，需要在甲狀旁腺激素相關肽Ihh的表達和間接調(diào)控過程中進行，Ihh可以抑制肥大軟骨細胞的分化，特別是當甲狀旁腺激素相關肽缺乏時，Ihh不能依賴于促進軟骨細胞肥大[12-15]。因此，在Ihh缺失的情況下，甲狀旁腺激素相關肽可以抑制膠質(zhì)瘤相關癌基因同源家族的轉錄因子，從而抑制下游基因的表達[16]。通過IHH條件基因敲除小鼠的研究發(fā)現(xiàn)，Ihh信號通路與骨關節(jié)炎進展過程中的病理變化有關，敲除Ihh基因可在組織、細胞和分子水平上預防關節(jié)軟骨的破壞[17-18]。另外，有學者發(fā)現(xiàn)敲除Ihh基因的小鼠四肢較短，軟骨細胞增殖減少[19-20]。其次Ihh在出生后骨發(fā)育中起著重要作用[21-22]。MicroCT是一種全面、三維、準確的骨骼微結構檢測方法，能有效描述組織的三維結構，彌補了病理切片、X線等二維觀察方法的不足[23-24]。本研究中采用托馬西酚溶液抑制雌激素活性的化合物，可抑制機體的生長發(fā)育過程，減少對增殖型與肥大型軟骨細胞過渡區(qū)域的刺激，抑制Ihh的分泌，因此托馬西酚溶液能夠有效敲除Ihh基因。進一步通過提取肋軟骨細胞總RNA并測定Ihh基因是否敲除成功，所納入的40只小鼠均成功敲除Ihh基因，常規(guī)飼養(yǎng)至12周齡，飼養(yǎng)過程中兩組中各1只死亡，12周齡時對剩余38只小鼠實施無菌條件下腓骨骨折造模，最終成功造模36只。造模后3周兩組小鼠骨折線均非常模糊，且觀察組程度較低，造模后2周、3周時對照組小鼠的Micro-CT各參數(shù)均優(yōu)于觀察組。VEGF是特異性較高的促學管內(nèi)皮細胞生長因子，可促進血管通透性增加，促使血管內(nèi)皮細胞增殖和遷移，促進血管形成，其水平降低時不利于腓骨骨折小鼠的血管增生；TGF-β1為一種多功能蛋白質(zhì)，對細胞的生長、分化、凋亡和免疫等均有重要的調(diào)節(jié)作用，其能夠與細胞表面的受體相結合，進而激活信息傳遞通路，其水平降低說明腓骨骨折小鼠的骨細胞增殖、分化能力較弱，說明骨折愈合情況不佳；ALP在臨床中常用于對肝膽系統(tǒng)、骨骼疾病的診斷和鑒別，其水平降低常預示著人體出現(xiàn)重癥慢性腎炎、貧血、甲狀腺機能不全等，說明腓骨骨折小鼠術后愈合情況不佳；BGP是骨代謝中常用的生化標志物，其由成牙質(zhì)細胞、骨細胞合成，少量由增生的軟骨細胞合成，可調(diào)節(jié)骨鈣代謝，其水平降低不利于骨性骨痂的生成及骨折的愈合。且造模后2周、3周時觀察組小鼠的血清VEGF、TGF-β1、ALP、BGP水平均低于對照組，造模后2周、3周時觀察組小鼠的血清鈣離子濃度均高于對照組。這說明Ihh基因敲除后骨折中晚期骨折區(qū)域內(nèi)VEGF、TGF-β1、ALP、BGP水平表達均降低，會抑制骨痂成骨，影響骨折預后，這與既往研究中的結果相似。進一步探究發(fā)現(xiàn)，ABH染色圖片顯示造模后1周兩組骨痂可見較多軟骨成分；造模后2周兩組軟骨成分相似，對照組出現(xiàn)骨性骨痂；由圖可見與造模后1周、2周相比，造模3周觀察組僅出現(xiàn)少量骨性骨痂，骨小梁形狀明顯小于對照組，且形狀不規(guī)則，而對照組的骨小梁形狀較觀察組規(guī)則、粗大。這可能與骨折區(qū)域的VEGF、TGF-β1、ALP、BGP表達相關，而Ihh基因敲除后上述因子表達水平降低，因此損傷區(qū)域血管新生受到抑制，纖維骨痂軟骨內(nèi)成骨抑制[25]。

綜上所述，Ihh基因敲除會抑制腓骨骨折小鼠血管增生，降低鈣磷水平，進而影響骨性骨痂的生成，延緩骨折的愈合。但是本研究中尚未明確其具體作用機制，今后仍需進一步探究和完善，以提高臨床應用性。