黃甫靜，張金娟，董莉，馮敏，廖尚高，何迅

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；3.葵花藥業(yè)集團(tuán)貴州宏奇有限公司，貴州 六盤水 553400；4.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)藥衛(wèi)生管理學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

脾虛證泛指因脾氣虛損引起的一系列脾臟生理功能失常的病理現(xiàn)象及病癥。飲食不節(jié)、勞逸失度、久病體虛等都會(huì)使脾氣受損而引起脾虛證的發(fā)生，繼而出現(xiàn)神疲、乏力、厭食、便溏和腹痛等癥狀?，F(xiàn)代研究表明，“脾失健運(yùn)”主要表現(xiàn)為胃腸消化、吸收功能的減弱和胃腸內(nèi)分泌的失調(diào)[1-3]，以及免疫功能降低等方面的改變[4-6]，是多器官、多系統(tǒng)出現(xiàn)功能減退的綜合性證候[7]，胃腸功能紊亂是其病理改變的主要特征。芪斛楂顆粒系由黃芪、山藥、炙甘草等11味藥味組成的中藥制劑，在用于治療小兒脾胃氣虛、脾失健運(yùn)證引起的厭食、偏食、汗多、大便不調(diào)、易感冒等癥狀時(shí)療效顯著，但其改善脾虛引起的胃腸功能紊亂和免疫力低下的作用尚不明確。本研究采用飲食不節(jié)、過度勞累和苦寒破氣相結(jié)合的復(fù)合因素法建立脾虛大鼠模型，觀察芪斛楂顆粒對(duì)脾虛模型大鼠胃腸功能及免疫系統(tǒng)的影響，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥物與試劑 番瀉葉(亳州市茸文堂藥業(yè)有限公司,批號(hào)200708)、補(bǔ)中益氣顆粒(北京漢典制藥有限公司,批號(hào)191139)、芪斛楂顆粒[葵花藥業(yè)集團(tuán)(貴州宏奇),批號(hào)20190401]、胃泌素(gastrin，GAS)、胃動(dòng)素(motilin，MTL)、生長(zhǎng)抑素(somatostatin，SS；武漢華美生物工程有限公司,批號(hào)X23014011、X21014009、X22014010)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α；深圳欣博盛生物科技有限公司,批號(hào)200106-102a)、白介素-1β(interleukin，IL-1β；河南九邦生物科技有限公司,批號(hào)Nov 2020)。

1.1.2儀器 多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)、Centrifuge 5810R 型高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、Step One PlusTM型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(美國Thermofisher scientific公司)、CP124C型電子天平[奧豪斯儀器(常州)有限公司]。

1.1.3動(dòng)物 雄性SD大鼠，無特定病原體(specefic pathogen free，SPF)級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SCXK(黔)2018-0001。

1.2 方法

1.2.1動(dòng)物分組、造模與給藥 雄性SD大鼠30只，采用飲食不節(jié)、過度疲勞和苦寒破氣相結(jié)合的復(fù)合因素法建立脾虛大鼠模型。造模方法參照文獻(xiàn)[16]，于造模第1～14天，奇數(shù)日給予豬油(10 mL/kg)灌胃，并以實(shí)驗(yàn)鼠飼料喂養(yǎng)，偶數(shù)日僅以白菜喂養(yǎng)并使大鼠于室溫下游泳至力竭；第15～21天，給予番瀉葉水提物(0.5 g/kg)灌胃。取同批次未造模大鼠10只作為對(duì)照組。將造模成功的30只脾虛大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對(duì)照組(補(bǔ)中益氣顆粒，630 mg/kg)以及芪斛楂顆粒組(200 mg/kg)，每組10只；各組大鼠予相應(yīng)藥物灌胃，對(duì)照組和模型組予等量蒸餾水灌胃，每天1次，連續(xù)10 d。末次給藥后24 h，水合氯醛麻醉各組大鼠，心臟采血，常溫靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，取血清，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2外觀行為學(xué)評(píng)分和體質(zhì)量 記錄各組每只大鼠的外觀行為學(xué)變化，按行為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8-9]進(jìn)行評(píng)分(表1)；每周稱量大鼠的體質(zhì)量?jī)纱?，參照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合大鼠體質(zhì)量變化情況，評(píng)分顯著升高且體質(zhì)量顯著降低的大鼠評(píng)價(jià)為脾虛模型大鼠，以造模成功的大鼠進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，末次給藥后按評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)再次對(duì)各組大鼠進(jìn)行評(píng)分。

表1 各組大鼠外觀行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Appearance and behavior evaluation scale of rats in each group

1.2.3胸腺、脾臟指數(shù)測(cè)定 采血后，脫頸椎處死大鼠，取胸腺和脾，計(jì)算胸腺、脾臟指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量×100%。

1.2.4血清GAS、MTL、SS、TNF-α、IL-1β含量 取各組大鼠血清，采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中GAS、MTL、SS、TNF-α、IL-1β的含量，按照各試劑盒的說明書進(jìn)行操作，均使用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 外觀行為學(xué)評(píng)分和體質(zhì)量

與對(duì)照組比較，模型組大鼠外觀行為學(xué)評(píng)分顯著升高(P<0.01)、體質(zhì)量降低(P<0.01)。與模型組比較，陽性對(duì)照組和芪斛楂顆粒組大鼠外觀行為學(xué)評(píng)分值顯著下降(P<0.01)、體質(zhì)量增加(P<0.01)；給藥結(jié)束后，陽性對(duì)照組和芪斛楂顆粒組大鼠體重已趨于正常水平，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2和圖1。

表2 末次給藥后各組大鼠外觀行為學(xué)評(píng)分Tab.2 Appearance and behavior scores of rats in each group after the last

圖1 給藥期間各組大鼠體質(zhì)量變化Fig.1 Changes in body mass of rats in each group during administration

2.2 胸腺、脾臟指數(shù)的影響

與對(duì)照組比較，模型組大鼠胸腺、脾指數(shù)均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，陽性對(duì)照組和芪斛楂顆粒組大鼠的胸腺、脾指數(shù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01。圖2 芪斛楂顆粒對(duì)脾虛大鼠胸腺、脾指數(shù)的影響Fig.2 Effect of qihuzha granules on thymus and spleen index in rats with spleen deficiency

2.3 血清GAS、MTL及SS水平

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清GAS、MTL水平顯著降低(P<0.01)、SS含量顯著上升(P<0.01)；與模型組比較，陽性對(duì)照組和芪斛楂顆粒組大鼠血清GAS、MTL水平顯著升高(P<0.01)、血清SS含量顯著降低(P<0.01)。見圖3。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01。圖3 芪斛楂顆粒對(duì)脾虛模型大鼠胃腸激素的影響Fig.3 Effect of qihuzha granules on gastrointestinal hormones in rats with spleen deficiency

2.4 血清TNF-α、IL-1β水平

與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平上升(P<0.01)；與模型組比較，陽性對(duì)照組和芪斛楂顆粒組大鼠血清TNF-α、IL-1β水平顯著降低(P<0.01)。見圖4。

3 討論

中醫(yī)理論中的脾是多個(gè)器官和系統(tǒng)的集合，除西醫(yī)解剖學(xué)中的脾臟外，還包括了消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等多個(gè)系統(tǒng)及器官[10]。因此，中醫(yī)理論中的脾虛是指因過勞過逸、飲食不節(jié)、思慮過度等原因引起的多個(gè)器官或系統(tǒng)功能低下的證候。采用飲食不節(jié)、過度勞累和苦寒破氣的復(fù)合因素建立脾虛大鼠模型的方法充分模擬了中醫(yī)脾虛癥的病因，具有脾虛癥狀明顯、重復(fù)性高、穩(wěn)定性強(qiáng)的特點(diǎn)，已成為研究脾虛癥較為經(jīng)典的模型[11-14]。本研究中，采用奇數(shù)日灌胃豬油、偶數(shù)日喂食白菜，使大鼠游泳至力竭，于造模第15天開始予番瀉葉水提物灌胃的方法模擬脾虛大鼠模型。造模后，大鼠的體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢且顯著低于對(duì)照組，出現(xiàn)食量減少、便型稀軟、瞇眼弓背、毛發(fā)枯燥、懶動(dòng)等癥狀，胸腺、脾指數(shù)顯著降低，反映出脾虛大鼠模型的外觀行為、臟器系數(shù)的變化；而且大鼠血清GAS、MTL水平顯著降低，TNF-α、IL-1β和SS顯著上升，提示脾虛大鼠的胃腸功能、免疫系統(tǒng)有一定的受損。以上結(jié)果表明采用飲食不節(jié)、過度勞累結(jié)合苦寒破氣的復(fù)合因素造模后可引起胃腸功能和免疫系統(tǒng)異常，從而更接近臨床脾虛證侯。

注：(1)與對(duì)照組比較，P<0.01；(2)與模型組比較，P<0.01。圖4 芪斛楂顆粒對(duì)脾虛模型大鼠血清TNF-α和IL-1β的影響Fig.4 Effect of qihuzha granules on serum TNF-α and IL-1β in rats with spleen deficiency

本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)復(fù)制成功的脾虛大鼠模型給予芪斛楂顆粒進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示：與模型組比較，芪斛楂顆粒組大鼠的外觀行為學(xué)評(píng)分顯著下降、體質(zhì)量顯著升高，提示芪斛楂顆粒通過緩解脾虛大鼠的外觀行為學(xué)癥狀，使大鼠的體質(zhì)量逐漸增加。

脾臟對(duì)維持機(jī)體免疫系統(tǒng)功能的正常運(yùn)轉(zhuǎn)有重要作用，研究表明脾虛證可導(dǎo)致機(jī)體全身和局部免疫功能低下[15]。胸腺和脾臟在維持機(jī)體正常免疫功能中，發(fā)揮了極為重要的作用[16-18]。胸腺指數(shù)、脾指數(shù)的變化能夠反映脾虛模型大鼠機(jī)體免疫功能恢復(fù)的狀況。TNF-α和IL-1β主要參與免疫應(yīng)答、造血和炎癥的調(diào)節(jié)，是機(jī)體發(fā)生細(xì)胞免疫時(shí)的關(guān)鍵性細(xì)胞因子，對(duì)免疫細(xì)胞的增殖與活化均有較強(qiáng)的作用[19]。機(jī)體在脾虛時(shí)出現(xiàn)免疫功能紊亂，細(xì)胞因子異常分泌，使TNF-α和IL-1β的含量增多，進(jìn)一步的加重機(jī)體胃腸道等的損傷而加重脾虛的癥狀。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)給藥干預(yù)后，脾虛模型大鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)均較模型組顯著上升，TNF-α和IL-1β的含量均較模型組顯著下降，提示芪斛楂顆?？赡芡ㄟ^上調(diào)脾虛大鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，減少血清TNF-α和IL-1β的含量來改善脾虛大鼠的免疫功能而起到保護(hù)作用。

研究表明脾虛證與胃腸道的胃腸激素分泌、胃腸免疫調(diào)節(jié)功能障礙等多種病理生理改變都有關(guān)系[20-21]。胃腸激素在調(diào)節(jié)胃腸平滑肌收縮、促進(jìn)胃腸道分泌和維持胃腸道屏障等方面具有重要作用[22-23]。MTL、GAS、SS均是重要的胃腸激素，具有促進(jìn)或抑制胃腸運(yùn)動(dòng)，加速胃腸黏膜再生的作用，三者均能很好的體現(xiàn)胃腸功能變化[24-25]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)芪斛楂顆粒干預(yù)后，脾虛模型大鼠血清GAS、MTL的含量較模型組在不同程度上有所上升，血清SS有所下降，提示芪斛楂顆粒改善脾虛大鼠胃腸功能可能與其調(diào)節(jié)胃腸激素的作用有關(guān)。

涂?jī)x軍[26]的研究中提到，IL-1β可導(dǎo)致胃腸功能紊亂，TNF-α可引起局部炎癥反應(yīng)。本研究中，脾虛大鼠血清中IL-1β和TNF-α的水平上升，同時(shí)GAS、MTL和SS等胃腸激素的分泌水平也出現(xiàn)了異常，其可能原因?yàn)槠⑻撟C引起機(jī)體免疫功能降低，從而導(dǎo)致機(jī)體胃腸屏障功能低下，胃腸激素分泌異常。本研究結(jié)果顯示，芪斛楂顆?？梢酝ㄟ^提高脾虛模型大鼠胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、GAS、MTL含量，降低SS、TNF-α、IL-1β含量，從而改善脾虛大鼠胃腸、免疫功能。