劉巍巍，國果，吳兆穎，毛成菊，李忠旬，賈利娜，尚小麗，彭建**，吳建偉**

(1.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 人體寄生蟲學教研室，貴州 貴陽 550025；2.貴州醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 現(xiàn)代病原生物學特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025；3.貴州醫(yī)科大學 生物工程學院，貴州 貴陽 550025)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii，AB)生物被膜是疾病發(fā)病機理中重要的毒力因子[1]。與生物被膜感染相關的疾病發(fā)病率不斷上升，且治療更加困難。最常見的生物被膜感染包括口腔牙周炎、慢性中耳炎、鼻竇炎、尿路感染以及囊性纖維化患者的肺部感染等[2]。細菌通過附著在宿主組織(牙齒、黏膜表面等)形成生物被膜，抗生素難以徹底清除，導致慢性反復感染[3]；另一種情況是細菌對非生物表面的粘附，如在留置醫(yī)療器械或生物材料(中央靜脈導管、氣管導管、人工心臟瓣膜、隱形眼鏡等)表面形成生物被膜，并且細菌會從生物被膜上脫落并擴散到機體周圍組織或血液中，進一步加劇感染[4]。研究表明，生物被膜表型是異質性的，不同的菌株能形成不同的生物被膜，白色念珠菌臨床分離株形成生物被膜強和弱的菌株導致的感染預后不同，與死亡率顯著相關[5]。研究報道，白色念珠菌中高生物被膜形成能力的菌株比低生物被膜形成能力的菌株具有更高的致病性[6]。與環(huán)境菌株相比，鮑曼不動桿菌臨床分離菌株具有更高的形成強生物被膜的能力[7]。對100株分離自重癥監(jiān)護病房的鮑曼不動桿菌進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)58%的菌株表現(xiàn)出很強的生物被膜形成能力，且所有強生物被膜形成能力的菌株都為泛耐藥菌株[8]。臨床耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌(carbapenem-resistant AB，CRAB)是一種類似耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的超級耐藥菌，其形成生物被膜后對抗生素的耐藥性進一步提高[9]。本研究中，采集臨床分離CRAB，通過對生物被膜形成能力強和弱的菌株進行轉錄組測序，比較兩種不同生物被膜形成能力菌株的基因表達差異，探究導致其生物被膜形成差異的原因，以期為臨床CRAB生物被膜形成機制以及感染的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株 CRAB 4、13、55、78、117、177、191和196號菌株分離于臨床住院患者痰液、血液樣本。大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853為質控菌，由貴州醫(yī)科大學病原生物學實驗室保存。

1.1.2實驗試劑與儀器 Mueller-Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基、Trypticase Soy Broth(TSB)肉湯培養(yǎng)基和Luria-bertani(LB)固體培養(yǎng)基、結晶紫粉末均購自北京索萊寶公司，溶菌酶(購自上海生工公司)、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(大連寶生物公司)，RIZOL(美國invitrogen公司)。恒溫培養(yǎng)箱購自上海博訊實業(yè)，細菌比濁儀購自上海昕瑞有限公司，高壓蒸汽鍋購自日本ALR公司，微量加樣槍、PCR擴增儀、速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，ABI7300熒光定量PCR儀購自美國ABI公司，NanoDrop ND-2000分光光度計(美國Thermo公司)。

1.2 方法

1.2.1臨床菌株鑒定及生物被膜的培養(yǎng)和收集 細菌的鑒定與藥敏試驗均采用法國生物梅里埃VITEK-2全自動微生物分析儀進行分析，同時對菌株的16SrRNA和rpoB基因進行擴增，并對PCR產(chǎn)物進行測序和分析，以保證菌株鑒定的準確性。選取生物被膜形成能力強(CRAB 4、55、78、117)的菌株作為強生物被膜(biofilm，BF)組，作為4個生物學重復，菌株在形態(tài)和特性上相似。取培養(yǎng)至對數(shù)期的菌液，用TSB培養(yǎng)基稀釋至每毫升106cfu。取菌液4 mL加入6孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，然后棄去游離菌液，PBS清洗后用細胞刮刀刮取生物被膜菌。選取生物被膜形成能力弱(CRAB 13、177、191、196)的菌株作為弱生物被膜(weak biofilm，WBF)組，作為4個生物學重復，菌株在形態(tài)和特性上相似，余按BF組方法培養(yǎng)并收集生物被膜菌。

1.2.2RNA提取與質量檢測 參考文獻[10]的方法，先使用溶菌酶對樣品進行預處理，再加入TRIZOL溶液裂解，冰上靜置15 min。加入氯仿200 μL混勻，冰上靜置5 min，4 ℃，12 000 r/min離心15 min。RNA位于上層水相中，小心吸取上清液，轉入新的離心管中。加入等體積的異丙醇混勻，室溫靜置10 min，4 ℃，12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入75%乙醇(預冷)1 mL，輕輕吹打混勻，溶解沉淀，4 ℃，7 500 r/min離心5 min，棄上清，室溫干燥10 min。加入焦炭酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate,DEPC)水30～50 μL溶解沉淀，分裝，置于-80 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA降解情況，通過分光光度計(NanoDrop ND-2000)測定RNA濃度。

1.2.3文庫構建和轉錄組測序(RNA-Seq) 提取到的RNA經(jīng)檢測合格后，去除Total RNA中的核糖體RNA(rRNA)，獲得mRNA。隨后加入fragmentation buffer將得到的mRNA隨機打斷成短片段，按照鏈特異性建庫的方式建庫[11]。文庫構建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer進行初步定量，隨后使用Agilent 2100 bioanalyzer對文庫的insert size進行檢測，insert size符合預期后通過實時熒光定量PCR(quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)對文庫有效濃度進行準確定量，以保證文庫質量。庫檢合格后，把不同文庫按照有效濃度及目標下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后進行Illumina測序。

1.2.4數(shù)據(jù)分析 以鮑曼不動桿菌AB030(NZ_CP009257.1)的基因組作為參考基因組，用Bowtie2軟件進行基因組定位分析[12]。HTSeq v0.6.1用于計算映射到每個基因的讀數(shù)，使用DESeq軟件分析兩個比較組合之間的差異表達(每個組4個生物學重復)。通過DESeq統(tǒng)計程序，將基于負二項式分布的模型確定數(shù)字基因表達數(shù)據(jù)中的差異表達。使用Benjamini和Hochberg的方法來調整所得P值，設置差異基因篩選的標準[13]：校正后的P值 padj<0.05，且|log2(fold change)|>1。對差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)進行基因本體(geneontology，GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析。

1.2.5實時熒光定量PCR驗證差異基因 從轉錄組測序鑒定得到的DEGs中挑取8個差異基因(表1)，利用qRT-PCR驗證差異基因。按之前所述方法提取RNA后，用逆轉錄試劑盒將提取的總RNA逆轉錄成cDNA。PCR擴增總反應體系20 μL(cDNA模板2.0 μL、SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 10 μL、ROX Reference Dye(50×)0.4 μL、ddH2O 6.0 μL、上下游引物各0.8 μL)。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火31 s，共40個循環(huán)。反應在ABI7300熒光定量PCR儀上進行，以AB 16SrRNA為內參基因，目的基因的相對表達量采用2-ΔΔCT方法計算。

表1 Real-time PCR引物Tab.1 Real-time PCR primers

2 結果

2.1 RNA質量

總RNA條帶完整清晰，無雜帶，樣本無污染(圖1)。通過Agilent 2100 bioanalyzer精確檢測顯示，RIN值8～10，RNA完整性好；檢測RNA純度，OD260/280為1.8～2.2，OD260/230>1.8。樣品滿足后續(xù)建庫和試驗要求。見表2。

注：M為marker條帶，1～4為BF組總RNA，5～8為WBF組總RNA。圖1 RNA瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 RNA sepharose gel electrophoretogram

表2 RNA樣品質量信息Tab.2 RNA sample general information

2.2 mRNA測序數(shù)據(jù)

樣品測序結果顯示錯誤率為 0.03%，顯示測序結果可靠。每組樣品的 clean reads 數(shù)據(jù)>1G ，測序深度足夠覆蓋所有可能存在的基因。Q20>97%，Q30>92%，實驗所產(chǎn)生的測序reads成功比對到基因組的比例高于82%，其中具有多個定位的測序序列占總體的百分比<7%，符合后續(xù)分析的要求。見表3。

表3 各樣品mRNA測序數(shù)據(jù)Tab.3 Sample mRNA sequencing data

2.3 基因表達差異分析

DEGs的火山圖顯示，與WBF組比較，BF組有171個基因差異表達，包括106個上調(紅色)的基因和65個下調(綠色)的基因(圖2)。ATP相關基因：LamB/YcsF家族蛋白(IX87_RS04005)參與ATP水解等過程，其 log2(fold change)值為-3.48；ATP合酶亞基α(IX87_RS15035)、ATP合酶亞基β(IX87_RS15045)、ATP合酶亞基γ(IX87_RS15040)、ATP合酶亞基δ(IX87_RS15030)的log2(fold change)值分別為-2.1、-2、-2.3和-2.2。DNA結合轉錄調節(jié)相關基因：DNA結合蛋白(IX87_RS19850)的log2(fold change)值為3.8；AraC家族轉錄調節(jié)因子(IX87_RS19260)、XRE家族轉錄調節(jié)子(IX87_RS02480)、Lrp/AsnC家族轉錄調節(jié)因子(IX87_RS02640)均為DNA結合轉錄調節(jié)相關基因，log2(fold change)值分別為2.7、2.1和1.7。菌毛合成相關基因：菌毛合成調控相關蛋白CsuA(IX87_RS06910)的log2(fold change)值為2.6。膜相關基因：外膜蛋白(IX87_RS01665)的log2(fold change)值為-2.1；外膜孔蛋白OmpW家族蛋白(IX87_RS06185)參與鐵的吸收和黏附素的結合過程，log2(fold change)值為2.4。上調的DEGs主要涉及DNA結合、膜蛋白、菌毛調控相關基因等，下調的DEGs主要涉及ATP的合成和分解、外膜蛋白等。見圖2。

注：紅、綠點分別為上調和下調的DEGs，藍點為不顯著DEGs。圖2 DEGs火山圖Fig.2 DEGs volcanoplot

2.4 差異基因GO富集分析

GO富集分析結果顯示最顯著的30個GO條，如陽離子跨膜轉運(cation transmembrane transport)、質子跨膜轉運(proton transmembrane transport)、嘌呤核糖核苷酸代謝過程(purine ribonucleotide metabolic process)、嘌呤核苷酸的生物合成過程(purine nucleotide biosynthetic process)、核糖核苷酸代謝過程(ribonucleotide metabolic process)、核糖核苷酸的生物合成過程(ribonucleotide biosynthetic process)、ATP代謝過程(ATP metabolic process)及ATP生物合成過程(ATP biosynthetic process)等顯著富集于生物過程；質子轉運雙扇形ATP酶復合物，催化結構域(proton-transporting two-sector ATPase complex,catalytic domain)及質子轉運ATP酶復合物(proton-transporting ATP synthase complex)顯著富集于細胞組分；ATP酶活性，與離子的跨膜轉運耦合、旋轉機制(ATPase activity,coupled to transmembrane movement of ions,rotational mechanism)、活性離子跨膜轉運蛋白活性(active ion transmembrane transporter activity)等顯著富集于分子功能類別。見圖3。

注：(1)P<0.05。圖3 DEGs的GO富集分析Fig.3 GO enrichment analysis of DEGs

2.5 差異基因KEGG富集分析

KEGG富集分析結果表明，DEGs參與的KEGG代謝通路中最顯著的通路有20條，分別為纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解(valine,leucine and isoleucine degradation)、氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)、糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis)、β-丙氨酸代謝(beta-alanine metabolism)、泛酸和CoA生物合成(pantothenate and CoA biosynthesis)、代謝途徑(metabolic pathways)、香葉醇的降解(geraniol degradation)、RNA降解(RNA degradation)、丙酮酸代謝(pyruvate metabolism)、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(alanine,aspartate and glutamate metabolism)、組氨酸代謝(histidine metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝(arginine and proline metabolism)、半乳糖代謝(galactose metabolism)、檸檬烯和蒎烯降解(limonene and pinene degradation)、硫代謝(sulfur metabolism)、抗生素的生物合成(biosynthesis of antibiotics)、脂肪酸代謝(fatty acid metabolism)、萬古霉素耐藥(vancomycin resistance)、肽聚糖的生物合成(peptidoglycan biosynthesis)和甲烷代謝(methane metabolism)。見圖4。

2.6 DEGs的驗證

從轉錄組差異基因中挑選8個基因，其中上調和下調表達的基因分別為5和3個；采用qRT-PCR驗證不同生物被膜形成能力的兩組菌株的差異，該結果與轉錄組結果趨勢一致，表明轉錄組數(shù)據(jù)可靠。見圖5。

注：橫坐標為基因富集指數(shù)，縱坐標為信號通路名稱。圖4 DEGs的KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment scatter plot of DEGs

圖5 8個差異基因表達水平的比較(RNA-Seq、qTR-PCR)Fig.5 Expression of 8 differential genes(RNA-Seq，qTR-PCR)

3 討論

細菌耐藥問題一直備受關注，研究表明，細菌在受到抗菌藥物等外界壓力刺激下會發(fā)生耐藥基因的變化，上調耐藥基因的表達或進化以獲得某些特性，導致多重耐藥、泛耐藥菌株的克隆流行[14-15]。近年來，CRAB的檢出率逐年上升，已被多次報道[16-17]。鮑曼不動桿菌形成生物被膜是其重要的毒力因子，與一般的細菌導致的感染相比，生物被膜能為菌體提供持續(xù)的防護，幫助細菌適應不利的外環(huán)境和躲避宿主的攻擊，形成穩(wěn)定釋放細菌的慢性感染源，導致感染反復發(fā)生，同時會增強對抗菌藥物的抵抗能力，可由敏感變成耐藥，給治療帶來更大的阻礙[18-19]。了解臨床CRAB形成不同生物被膜的分子機制，對其導致的嚴重感染的防治和診斷等研究有著重要的意義。

轉錄組測序是研究基因表達變化的重要手段，轉錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結構，揭示特定的生物學過程，已廣泛應用于基礎研究、臨床診斷和藥物研發(fā)等領域[20]。經(jīng)RNA-Seq分析，將生物被膜形成能力強和弱的臨床分離CRAB生物被膜態(tài)菌進行比較，獲得171個DEGs，其中106個基因為上調表達，65個基因下調表達；隨機挑取了8個差異基因進行qRT-PCR驗證，其結果與轉錄組測序結果一致，表明測序結果可靠。DEGs主要包括ATP水解和合成相關基因、DNA結合轉錄調控因子、外膜蛋白以及菌毛調控基因。值得注意的是，與生物被膜形成能力弱組相比，生物被膜形成能力強組中菌毛調控相關基因CsuA表達上調，表明菌毛加快合成，促進生物被膜的形成。細菌對宿主表面的粘附是形成生物被膜的第一步。菌毛則介導了細菌對非生物表面的粘附，幫助細菌在新的表面定殖[21]。研究表明，外膜蛋白參與生物被膜的形成，特別是在初始粘附階段發(fā)揮作用；相對于非生物表面，外膜蛋白OmpA被證明對于鮑曼不動桿菌19606粘附在生物表面的能力至關重要[22-23]。并且，CarO和OmpA等膜蛋白能和碳青霉烯酶OXA-23發(fā)生相互作用，從而提高對抗生素的耐藥性[24]。對多重耐藥鮑曼不動桿菌菌株與敏感菌株進行蛋白質組學比較，結果發(fā)現(xiàn)孔蛋白OmpW在多重耐藥菌株BAA-1605中顯著上調[25]。本研究中，與WBF組相比，BF組外膜蛋白基因(IX87_RS01665)表達下調，孔蛋白OmpW基因(IX87_RS06185)表達上調。這表明膜蛋白相關基因的變化影響臨床CRAB形成不同的生物被膜，且影響其耐藥性。GO富集分析顯示差異表達基因顯著富集到陽離子跨膜轉運、質子跨膜轉運、核酸及ATP的合成和代謝等生物合成過程中。KEGG富集分析主要涉及細菌的生化代謝途徑的改變，如各種氨基酸的代謝合成、氧化磷酸化等。以上結果都表明菌株之間的生化代謝途徑的改變對生物被膜形成能力的強弱有影響，而抗生素的生物合成、萬古霉素耐藥通路的變化表明細菌生物被膜形成能力與其對抗生素的耐藥性有關。

本研究通過轉錄組技術，探討臨床CRAB生物被膜形成能力不同的菌株之間基因表達的差異，鑒定出信號傳導和代謝過程等途徑相關基因，下一步，將選擇部分基因進行驗證和功能分析，從而為后續(xù)的分子機制研究提供一定的理論基礎。