向春燕，盛 靜，劉正富，肖 陳，楊怡樂

（重慶市黔江食品藥品檢驗所，重慶 409000）

茶葉含有茶多酚、植物堿等營養(yǎng)成分，是一種天然的、綠色的、健康的飲品，全球160多個國家和地區(qū)的30億多人有飲茶的習(xí)慣，是我國人們?nèi)粘Ｉ钪械谋匦杵穂1]，確保茶葉的質(zhì)量安全一直是茶葉生產(chǎn)者和消費者共同關(guān)注的焦點[2]。2016年我國出口歐盟的茶葉被曝檢測出高含量“高氯酸鹽”的事件引起了我國對茶產(chǎn)業(yè)新型污染物“高氯酸鹽”的廣泛關(guān)注[3]，推動了我國對茶葉高氯酸鹽相關(guān)研究工作的開展。研究表明長期攝入高劑量高氯酸鹽，對人體危害大，高氯酸鹽與碘離子結(jié)構(gòu)相似，可以與碘的轉(zhuǎn)運蛋白結(jié)合抑制人體對碘的吸收，進而影響促甲狀腺激素和甲狀腺激素的合成，干擾甲狀腺的正常生理功能，影響人體甲狀腺對碘的吸收，從而導(dǎo)致神經(jīng)損傷、甲狀腺功能障礙，甚至甲狀腺癌[4-5]。

茶葉中高氯酸鹽污染的來源很多，如茶樹種植過程中使用的化肥、灌溉用水、工業(yè)廢水或自來水中含氯消毒劑的過量使用以及包裝材料的遷移等。我國對高氯酸鹽污染的研究尚處在起步階段，缺乏系統(tǒng)的研究數(shù)據(jù)。歐盟有關(guān)組織擬將茶葉中的高氯酸鹽限量定為0.75 mg/kg[6]，目前國內(nèi)對茶葉等農(nóng)產(chǎn)品、加工食品中高氯酸鹽的檢測方法較少，對其限定值尚無明確標準。本試驗采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定茶葉中高氯酸鹽含量，該方法簡單快捷、準確可靠。

1 材料和方法

1.1 試劑、儀器與材料

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、超純水（由ELGA超純水系統(tǒng)提供）、石墨炭黑柱 （ProElut CARB，500 mg/6 mL，迪馬科技）、Cleanert MAS- QuEChERS（warters Oasis，2.0 mL）、HLB固 相 萃 取 柱（warters Oasis，60 mg/3 mL），高氯酸根離子標準溶液（濃度為999.7 μg/mL，美國O2Si公司）。

Waters Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國沃特世公司）、XPE204電子天平（梅特勒-托利多公司）、高速冷凍離心機（貝克曼庫爾特公司）、具塞離心管、IKA MS3 digital 渦旋儀（艾卡公司）、超聲波恒溫水浴振蕩器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

各類茶葉試樣來自慶渝東南、渝東北、渝西及主城周邊茶葉基地生產(chǎn)的名品茶葉。

1.2 試驗方法

1.2.1 試樣制備

（1）制樣。取適量有代表性的試樣，粉碎機粉碎后過40目篩，均分成兩份，分別裝入潔凈容器中，密封并標記，于常溫避光保存。

（2）提取。準確稱取1 g（精確至0.01 g）試樣置于50 mL 具塞離心管中，準確加入10 mL甲醇-水溶液（體積比65∶35），渦旋振蕩5 min，振蕩超聲提取30 min， 10 000 r/min常溫離心10 min，取上清液待凈化。

（3）凈化。吸取樣品上清液6.5 mL過預(yù)先活化的石墨化碳黑柱（使用前依次用5 mL乙腈、5 mL水活化重力條件下自然流出），棄去前5 mL流出液收集，流出液1.5 mL渦旋10 s，上清液過0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.2 標準溶液制備

（1）高氯酸根離子標準中間液的配制。準確移取高氯酸根離子標準溶液（濃度為999.7 μg/mL）100 μL于100 mL容量瓶中，用水定容配制成濃度為1 μg/mL高氯酸根離子標準中間液。

（2）高氯酸根離子標準工作溶液的配制。分別準確移取1 μg/mL高氯酸根離子標準中間液10 μL、40 μL、100 μL、200 μL、500 μL和1 000 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇水溶液配制成濃度為1 ng/mL、4 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的標準工作曲線。

1.2.3 色譜與質(zhì)譜條件

（1）液相色譜條件。色譜柱：Symergi Max-RP 2.5 μm，50 mm×2 mm（美國飛諾美Phenomenex公司）；按照色譜柱梯度洗脫程序?qū)ιV柱進行清洗；柱溫：40 ℃；進樣量： 3 μL；流動相：0.1%甲酸水、乙腈；流速：0.2 mL/min。

（2）質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI源）；掃描方式：負離子模式掃描；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；毛細管電壓：2.0 kV；脫溶劑溫度：500 ℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；錐孔氣流量：150 L/h；高氯酸鹽質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 高氯酸鹽質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

由于高氯酸鹽是極性化合物，易溶于水，分別試驗了C18和C12柱對高氯酸鹽分離效果的影響。采用反相C18色譜柱時，C18鏈占用空間大的特性導(dǎo)致了硅醇表面覆蓋率相對比較低，其他陰離子如硫酸根離子、氯離子對其干擾較大，高氯酸鹽保留效果不佳。Symergi Max-RP柱是C12柱，其C12鏈占用的空間比G18少,更容易鍵合，使C12的表面硅膠覆蓋率比C18的高25%，在非特性反應(yīng)中產(chǎn)生了更多的游離硅酮，也提供了跟C18色譜柱相等的疏水性保留及次甲基選擇性，使高氯酸鹽在柱子上得到了很好的保留，同時還產(chǎn)生了更尖銳的峰形。故試驗選用了Symergi Max-RP柱來作為分離柱。

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

通過查閱大量的文獻資料發(fā)現(xiàn)，提取茶葉中的高氯酸鹽主要采取3種溶劑，即水、甲醇、乙腈。用水作為提取溶劑時，雖然其對高氯酸鹽的溶解性強，但因為茶葉中的組分較為復(fù)雜，水的極性較強，萃取出了較多的非目標組分，在檢測時對目標物形成比較大的干擾。而在使用純甲醇和純乙腈作為提取溶劑時，提取得不夠完全，其中甲醇比乙腈的提取率更高。因此，使用甲醇-水溶液作為提取溶劑。

2.3 凈化柱的選擇

為了避免茶葉中的色素、揮發(fā)性有機酸，茶多酚等其他雜質(zhì)對準確性的干擾,筆者選擇了HLB小柱、石墨化炭黑小柱、Cleanert MAS-QuEChERS3種進行試驗。結(jié)果表明，石墨化炭黑小柱由于其表面的正六元環(huán)結(jié)構(gòu)，對平面分子有極強的親和力，所得的凈化液澄清、透明，去除色素效果明顯優(yōu)于其他兩種萃取柱。最后通過將3種凈化液上機對比發(fā)現(xiàn)，使用石墨化炭黑小柱也減小了基質(zhì)效應(yīng)，其高氯酸鹽的響應(yīng)值最高（見圖1）。因此，試驗選取石墨化炭黑小柱作為凈化柱。

圖1 不同凈化材料效果比較

2.4 靈敏度及線性范圍

當試樣量為1 g（精確至0.01 g）、定容體積為10.0 mL時，根據(jù)3倍信噪比確定本方法中高氯酸鹽的檢出限為0.008 mg/kg，10倍信噪比確定本方法中高氯酸鹽的定量限為0.02 mg/kg。本方法靈敏度高，可用于茶葉中高氯酸鹽的含量測定。將配制好的系列濃度的高氯酸鹽標準溶液按照本方法進行測定，以標準工作溶液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線。結(jié)果表明，高氯酸鹽在濃度1～100 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為y=719.049x+53.133，相關(guān)系數(shù)為0.999 3。

2.5 方法準確度

選擇合適的4種茶葉樣品，分別添加0.02～0.8 mg/kg的高氯酸鹽，每個濃度重復(fù)試驗6次，按照本方法進行測定，考察本方法的準確度。由表2可知，本方法測定茶葉中高氯酸鹽的回收率在83.5%～101.5%，相對標準偏差均＜6.0%，結(jié)果表明本方法具有良好的準確度。

表2 高氯酸鹽的回收率及RSD（n=6）

2.6 方法精密度

準確稱取8種茶葉樣品各6份，按照本方法進行測定，計算8種茶葉中高氯酸鹽的相對標準偏差。由表3可知，本方法測定茶葉中高氯酸鹽的相對標準偏差均＜4%，結(jié)果表明本方法具有良好的穩(wěn)定性。

表3 高氯酸鹽的精密度測定結(jié)果

2.7 樣品測試

根據(jù)采樣方案，將采購到的105組樣品（綠茶75組，紅茶14組，花茶10組，白茶6組）按照優(yōu)化確定的試驗方法進行測定，獲得相關(guān)數(shù)據(jù)，經(jīng)檢驗發(fā)現(xiàn)105批試樣均檢出高氯酸鹽，檢出量范圍為0.027 0～2.430 0 mg/kg。

3 結(jié)論

本試驗建立了一種用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定市售茶葉中高氯酸鹽含量的方法。該方法用甲醇-水溶液（65:35）提取，提取液用石墨化碳黑凈化柱進行處理凈化，流出液過0.22 μm濾膜，供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。該方法對茶葉中高氯酸鹽的回收率范圍為83.5%～101.5%，具有良好的準確度和精密度。方法檢出限為0.008 mg/kg，定量限為0.02 mg/kg，靈敏度良好。茶葉中高氯酸鹽在1～100 μg/mL線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.999 3。該方法具有操作簡單易上手、所用前處理方便、時間節(jié)省、普適性好等優(yōu)點，可適用于茶葉中高氯酸鹽殘留的日常檢測。