嚴(yán)國鴻，蔣昆霞，朱美玲，王雅心，吳蕙，徐偉

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院，福建 福州 350004；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)生物醫(yī)藥研發(fā)中心，福建 福州 350122)

蔞芍痙攣平來源于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院梁暉主任臨床經(jīng)驗(yàn)方，福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，方中包括瓜蔞、白芍、桂枝、川芎、地龍、華重樓、甘草7味藥材，此方具有清熱養(yǎng)陰，柔筋緩急，活血通絡(luò)之效。

蔞芍痙攣平顆粒在臨床顯示其干預(yù)腦卒中后癱瘓肢體肌肉痙攣療效確切，為了探索其發(fā)揮功效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，本研究采用血清藥物化學(xué)方法[1-4]，并且近年來超高效液相色譜串聯(lián)四級桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)越來越多的用于中藥血清藥物化學(xué)的分析[5-8]，通過高分辨質(zhì)譜對入血成分進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，因此本研究通過將UPLC-Q-TOF-MS應(yīng)用于蔞芍痙攣平顆粒灌胃給藥大鼠后的含藥血清的主要入血成分的鑒定分析，旨在揭示蔞芍痙攣平顆粒給藥后真正吸收入血、發(fā)揮抗腦卒中與神經(jīng)保護(hù)作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 I-class plus超高壓輸液系統(tǒng)串聯(lián)Zevo XS高分辨飛行時間質(zhì)譜儀(UPLC-Q-TOF-MS，美國Waters公司)；CPA225D 十萬分之一分析天平(Sartorius公司)；Milli-Q 超純水儀(美國Millipore公司)。

1.2 試藥 甲醇、乙腈(質(zhì)譜純，德國默克公司)；甲酸(色譜純，批號：F190210，阿拉丁試劑上海有限公司)；其余試劑均為分析純。原兒茶酸(批號：110809-200604)、芍藥苷(批號：110736-201842)、甘草苷(批號：111610-201908)、木犀草苷(批號：111720-201810)、肉桂酸(批號：110786-201503)、阿魏酸(批號：110773-201915)、甘草酸(批號：110731-202021)、重樓皂苷Ⅶ(批號：100081-201610)、重樓皂苷Ⅱ(批號：111591-201604)、重樓皂苷Ⅰ(批號：111590-201604)、沒食子酸(批號：110831-201906)、綠原酸(批號：110753-201716)、香草酸(批號：110776-201503)、甘草次酸(批號：110723-201715)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院；去苯甲酰基芍藥苷(批號：BBP03785)購于云南西力生物技術(shù)股份有限公司；1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖(批號：MUST-17060201)、兒茶素(批號：MUST-16081503)、氧化芍藥苷(批號：MUST-14081710)、異甘草苷(批號：MUST-15031204)、甘草素(批號：MUST-12022207)購于成都曼思特生物科技有限公司；芍藥內(nèi)酯苷(批號：150516)購于北京賽百草科技有限公司；芹糖甘草苷(批號：HS2113)、芹糖異甘草苷(批號：HS1209)、異甘草素-4′-O-芹糖(1→2)葡萄糖苷(批號：HS2991)、檸檬酸(批號：HS7792)、原兒茶醛(批號：HS9009)、芒柄花苷(批號：HS4862)、甘草皂苷G2(批號：HL00101)、苯甲酰芍藥內(nèi)酯苷(批號：HS1841)、苯甲酰芍藥苷(批號：HS3864)、4-羥基肉桂酸(批號：HS7400)購于寶雞市辰光生物科技有限公司；蔞芍痙攣平顆粒(福建省第二人民醫(yī)院院內(nèi)制劑，顆粒劑)。

1.3 動物 健康SPF級雄性SD大鼠12只，10～12周齡，體質(zhì)量(250±20)g，購自福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，動物許可證號：SYXK(閩)2019-0007，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，每天自由進(jìn)食、飲水。

2 方法

2.1 蔞芍痙攣平灌胃液的制備 取蔞芍痙攣平顆粒100 g，加入50%乙醇1 L回流提取2次(提取時間1 h)，合并濾液濃縮制得0.9 g·mL-1的灌胃液(按照臨床劑量折算成大鼠灌胃給藥劑量每天3.3 g·kg-1)。

2.2 空白血清及含藥血清樣品的制備 雄性健康SPF級SD大鼠6只，按3.3 g·kg-1劑量灌胃蔞芍痙攣平灌胃液，連續(xù)灌胃7 d，早晚各一次，分別于第7天末次給藥后15 min取材。異氟烷麻醉機(jī)麻醉后，腹主動脈取血，離心分離得含藥血清，-80 ℃存放備用。另取6只大鼠，同樣給藥方案進(jìn)行空白生理鹽水灌胃，分離得空白血清，-80 ℃存放備用。

2.3 血清樣品的處理方法 參考文獻(xiàn)方法[9]：精密吸取蔞芍痙攣平含藥血清2 mL至離心管中，加入10 mL甲醇，渦旋震蕩2 min，然后于高速離心機(jī)中以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，于室溫下N2吹干，殘?jiān)?00 μL 50%甲醇進(jìn)行超聲復(fù)溶后置于高速離心機(jī)中以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，即為蔞芍痙攣平含藥血清供試品。取空白血清2 mL，同法操作，制備空白血清供試品。

2.4 色譜、質(zhì)譜條件 色譜條件：Waters CORTECS C18(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)，流動相乙腈(A)-0.1%甲酸水(B)，梯度洗脫(0～0.5 min，87%A-13%B；0.5～4.5 min，80%A-20%B；4.5～6.5 min，68%A-32%B；6.5～9 min，10%A-90%B)，流速0.25 mL·min-1，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧負(fù)離子模式，掃描方式：一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜掃描模式，毛細(xì)管電壓2.5 kV，錐孔電壓3.00 V，脫溶劑氣流N2，流速800 L·h-1，脫溶劑溫度500 ℃，錐孔氣流N2，流速50 L·h-1，離子源溫度150 ℃，Extractor 3.00 V，碰撞氣體氬氣?？傠x子流色譜圖見圖1。

圖1 蔞芍痙攣平顆?？瞻籽?A)和含藥血清(B)總離子流色譜圖

2.5 單味藥的提取方法 分別取原料蔞芍痙攣平顆粒各味藥，包括瓜蔞、白芍、桂枝、川芎、地龍、華重樓、甘草，按照蔞芍痙攣平顆粒處方量提取方法進(jìn)行提取，濃縮至干，然后加入10 mL 50%乙醇超聲復(fù)溶，得各單味藥提取液，置于高速離心機(jī)中以10 000 r·min-1離心10 min，取上清液，再用50%甲醇稀釋100倍，過0.22 μm微孔濾膜，既得單味藥供試液，供LC-MS定性成分歸屬使用。

2.6 入血成分鑒定方法 精密吸取含藥血清和空白血清各2 μL，在“2.4”項(xiàng)下的色譜、質(zhì)譜條件下進(jìn)樣分析，得到高分辨質(zhì)譜的總離子流色譜圖，通過比較分析含藥血清色譜峰保留時間及一級質(zhì)譜(分子離子峰)和二級質(zhì)譜(二級子離子)信息，鑒定入血成分。具體鑒定方法：首先，根據(jù)高分辨質(zhì)譜總離子流色譜峰所得到的精確質(zhì)量數(shù)即獲得各個色譜峰的分子離子峰信息(MS1)，然后在Masslynx 4.2軟件中的Tools Elemental Composition軟件在10 ppm的質(zhì)量偏差范圍內(nèi)計(jì)算其精確分子式，對各個色譜峰進(jìn)行初步鑒定。其次，選擇MS1分子離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜碰撞誘導(dǎo)解離(CID)，獲得化合物相應(yīng)的二級子離子質(zhì)譜的裂解(MS2)信息，從而獲得各個色譜峰的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜信息，進(jìn)行結(jié)構(gòu)推測，同時根據(jù)對照品及文獻(xiàn)(蔞芍痙攣平各個藥味的化學(xué)成分研究)進(jìn)一步比對推測其結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 原形入血成分分析 通過對蔞芍痙攣平含藥血清總離子流色譜峰的質(zhì)譜信息采集和鑒定，結(jié)果鑒定蔞芍痙攣平顆粒入血成分共35個，其中31成分經(jīng)對照品比對確認(rèn)，鑒定結(jié)果見表1。

表1 蔞芍痙攣平顆粒主要化學(xué)成分鑒定結(jié)果

表1(續(xù))

表1(續(xù))

3.2 蔞芍痙攣平顆粒血清藥物化學(xué)成分歸屬及其質(zhì)譜裂解分析 對UPLC-Q-TOF-MS鑒定入血移行成分進(jìn)行分類歸屬，共鑒定得到了4類入血成分，共計(jì)35個成分，其中酚酸類化合物10個、單萜類化合物6個、黃酮類化合物9個、皂苷類化合物9個，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 蔞芍痙攣平含藥血清中鑒定的化學(xué)成分結(jié)構(gòu)

3.2.1 酚酸類 該類成分結(jié)構(gòu)中多含有羧酸基團(tuán)，傾向給出質(zhì)子，在負(fù)離子模式下靈敏度優(yōu)于正離子模式，形成[M-H]-的分子離子峰，在質(zhì)譜的二級裂解行為中多產(chǎn)生[M-H-CO2]-或者酯鍵裂解的二級子離子，以峰3為例，其分子離子峰為[M-H]-m/z169.114 9，經(jīng)高分辨質(zhì)譜計(jì)算其分子式為C7H6O5，與白芍中的沒食子酸分子量一致，然后經(jīng)CID二級裂解[M-H-CO2]-子離子峰m/z125.024 3，經(jīng)與對照品比對發(fā)現(xiàn)其二級數(shù)據(jù)與對照品一致，因此推測峰3為沒食子酸，其質(zhì)譜裂解推測見圖3A。采用同樣的方法，經(jīng)過對照品比對我們共鑒定確認(rèn)酚酸類成分10個：瓜氨酸(1)、沒食子酸(3)、原兒茶酸(4)、綠原酸(7)、原兒茶醛(8)、香草酸(9)、4-羥基肉桂酸(12)、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖(16)、阿魏酸(17)、肉桂酸(25)，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2a，這些酚酸類成分來源瓜蔞、白芍、川芎和桂枝。

3.2.2 單萜苷類 結(jié)構(gòu)由單萜苷元與葡萄糖和/或苯甲酰基、對羥基苯甲?；M成，主要來源于臣藥白芍，負(fù)離子模式下，一級質(zhì)譜的分子離子峰容易產(chǎn)生[M+HCOO]-，二級質(zhì)譜多表現(xiàn)出分子離子峰失去CH2O、葡萄糖基(Glc)、苯甲?；?Benzoyl)等基團(tuán)的丟失。以峰10為例，TOF-MS給出的分子離子峰m/z525.162 5，軟件計(jì)算分子式為C24H29O13，與芍藥苷加甲酸的離子峰[M+HCOO]-一致，在二級質(zhì)譜圖中的碎片離子327[M+HCOO-HCOOH-C7H7O2-CH2O]-,121[M+HCOO-HCOOH-C16H22O9]-,449[M+HCOO-HCOOH-CH2O]-,431[M+HCOO-HCOOH-CH2O-H2O]-，與對照品和文獻(xiàn)報道的芍藥苷[14]二級質(zhì)譜碎片離子相一致，確認(rèn)峰10為芍藥苷，質(zhì)譜裂解過程見圖3B。采用同樣的方法，經(jīng)過對照品比對我們共鑒定確認(rèn)單萜苷類成分6個：去苯甲?；炙庈?2)、氧化芍藥苷(5)、芍藥內(nèi)酯苷(10)、芍藥苷(11)、苯甲酰芍藥苷(26)、苯甲酰芍藥內(nèi)酯苷(27)，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2b，單萜苷類成分主要來源于臣藥白芍。

3.2.3 黃酮類 本次鑒定的黃酮包括黃酮苷、二氫黃酮、查爾酮和黃烷醇類，在一級質(zhì)譜上，黃酮類成分分子離子峰主要是[M-H]-峰，二級質(zhì)譜上多表現(xiàn)苷鍵裂解失去糖基產(chǎn)生[M-糖基]-的子離子峰和2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)發(fā)生RDA裂解，以甘草的主要黃酮類成分甘草苷鑒定為例，一級質(zhì)譜得到分子峰m/z417.118 6，計(jì)算分子式為C21H22O9，二級質(zhì)譜掃描發(fā)現(xiàn)其失去葡萄糖基(Glc)得到子離子m/z255，同時苷元母核結(jié)構(gòu)經(jīng)RDA1，3位裂解得135[A1,3]-，119[B1,3]-子離子峰，經(jīng)與甘草苷對照品比對確認(rèn)，其質(zhì)譜裂解推測見圖3C。采用類似的方法，經(jīng)過對照品和文獻(xiàn)比對，本研究中共鑒定黃酮成分9個：芹糖甘草苷(13)、甘草苷(14)、木犀草苷(15)、芹糖異甘草苷(18)、異甘草素-4′-O-芹糖(1→2)葡萄糖苷(19)、異甘草苷(20)、芒柄花苷(21)、甘草素(22)、3′-羥基-4′-甲氧基光甘草定(32)，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2c。黃酮類成分主要來源于甘草和瓜蔞。

3.2.4 皂苷類 本次鑒定的含藥血清的主要皂苷類成分主要來自甘草的三萜皂苷和重樓的甾體皂苷，其在質(zhì)譜上容易形成[M-H]-或[M+HCOO]-的分子離子峰，在二級質(zhì)譜上，甘草皂苷類成分主要表現(xiàn)為苷鍵斷裂失去葡萄糖醛酸(glucuronic acid，GlcA)，形成苷元的二級子離子峰和葡萄糖醛酸離子峰，而重樓皂苷分子離子峰均為[M+HCOO]-峰，而二級子離子則表現(xiàn)逐步脫糖基形成的子離子，以重樓皂苷Ⅱ?yàn)槔?，其分子離子峰為m/z1 059.537 4[M+HCOO]-計(jì)算其分子式為C52H84O22，二級質(zhì)譜掃描得到m/z1 013[M+HCOO-HCOOH]-,m/z867[M+HCOO-HCOOH-Rha]-,m/z721[M+HCOO-HCOOH-2Rha]-的子離子，并經(jīng)與對照品比對和文獻(xiàn)確認(rèn)，質(zhì)譜裂解過程見圖3D，采用該方法共鑒定9個皂苷類成分：烏拉爾甘草皂苷C(23)、甘草皂苷H2(24)、甘草皂苷G2(28)、甘草酸(29)、甘草酸異構(gòu)體(30)、重樓皂苷Ⅶ(31)、重樓皂苷Ⅱ(33)、重樓皂苷Ⅰ(34)、甘草次酸(35)，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2d。

圖3 沒食子酸(A)、芍藥苷(B)、甘草苷(C)、重樓皂苷Ⅱ(D)可能的質(zhì)譜裂解途徑

4 討論

針對蔞芍痙攣平顆粒含藥血清中化學(xué)成分復(fù)雜多樣性，本研究對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化：通過比較不同廠家色譜柱(Waters CORTECS C18、Shimadzu Inetsil C18、Ultimate Welch C18和Phenomenex Luna C18)對蔞芍痙攣平血清樣品的分離效果，最終選擇Waters CORTECS C18色譜柱。流動相系統(tǒng)經(jīng)過優(yōu)化選擇乙腈-0.1%甲酸水，質(zhì)譜經(jīng)過優(yōu)化發(fā)現(xiàn)負(fù)離子模式優(yōu)于正離子模式。因此，本研究選擇負(fù)離子模式作為質(zhì)譜檢測條件。

蔞芍痙攣平顆粒由瓜蔞、桂枝、白芍、川芎、地龍、重樓七味藥組成，臨床上用于腦卒中及腦卒中肢體痙攣的康復(fù)治療。本研究結(jié)果表明其入血原型成分有35種：首先，如單萜苷類，如芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等來源于復(fù)方臣藥白芍，現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為白芍單萜苷類具有良好的抗炎作用，如芍藥苷通過PI3K/AKT/GSK-3β途徑抑制炎癥反應(yīng)[14]，并且通過抑制T淋巴細(xì)胞IFN-γ的產(chǎn)生和NF-κB/IκBα信號通路降低炎癥反應(yīng)[15]，提示其可能對腦卒中后炎癥具有改善作用；其次，黃酮類成分如芹糖甘草苷、甘草苷、芒柄花苷、甘草素等則來自甘草，藥理研究表明甘草黃酮通過調(diào)節(jié)代謝紊亂、抑制ERK1/2-NF-κB通路、激活NRF2-Keap1通路和抑制線粒體凋亡途徑來保護(hù)PC12細(xì)胞免受皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性[16]，并且能減輕痛覺過敏和疼痛，提高神經(jīng)功能指數(shù)和運(yùn)動神經(jīng)傳導(dǎo)速度，對慢性縮窄誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[17]；君藥瓜蔞中黃酮類成分木犀草苷可以通過調(diào)節(jié)缺血/再灌注中自噬相關(guān)指標(biāo)來抑制缺血性腦損傷，也具有神經(jīng)保護(hù)作用[18]。第三，皂苷類成分如甘草酸、甘草次酸等來自甘草，重樓皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ等來自重樓，現(xiàn)代藥理研究表明甘草酸可以通過抑制HMGB1表達(dá)和易位來衰減神經(jīng)元損傷及下調(diào)炎性細(xì)胞因子的表達(dá)發(fā)揮在神經(jīng)疾病中的作用[19]，重樓皂苷Ⅰ通過調(diào)節(jié)凋亡因子(caspase-3、Bax和Bcl-2)、炎癥因子(TNF-α、IL-6、iNOS和IL-10)和氧化應(yīng)激標(biāo)志物(SOD、GSH、ROS和MDA)的表達(dá)，對神經(jīng)損傷具有良好的保護(hù)作用[20]。第四，酚酸類成分如沒食子酸、阿魏酸、綠原酸也是復(fù)方入血成分，分別來自方中的白芍、川芎和瓜蔞，現(xiàn)代藥理研究表明沒食子酸、阿魏酸、綠原酸成分均能有效抑制神經(jīng)損傷，具有顯著的改善神經(jīng)損傷作用[21-23]。另外，君藥瓜蔞主要成分瓜氨酸對人腦缺血損傷有治療作用[24]。

綜上，本研究采用液質(zhì)聯(lián)用-血清藥物化學(xué)研究鑒定了蔞芍痙攣平的35個血中移行成分，在腦卒中發(fā)生后，由于血腦屏障的破環(huán)，這些入血成分均有可能入腦發(fā)揮其各自功效，提示該方入血的單萜苷類、黃酮類、酚酸類、皂苷類等成分可能是蔞芍痙攣平治療腦卒中后肢體痙攣與神經(jīng)保護(hù)的主要體內(nèi)藥效物質(zhì)。