張婷，梁國棟，劉衛(wèi)東，肖云峰

(1.內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥新藥研發(fā)企業(yè)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種全身代謝性骨病，表現(xiàn)為骨量減少、骨組織中微細(xì)結(jié)構(gòu)被破壞，并伴有骨骼的易脆性、骨折的易患性增加的一種系統(tǒng)性退行性疾病，骨質(zhì)疏松癥以疼痛劇烈、背部彎曲、體型變矮、骨脆易折為臨床癥狀，由于其發(fā)生概率高，危害嚴(yán)重，已經(jīng)引起人們的高度重視[1]。蒙古民族過去是游牧民族，素有“馬背上的民族”之譽(yù)稱。由于生活習(xí)慣和生活方式的特點，其骨傷、骨折的發(fā)生率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于一般民族。并且其飲食習(xí)慣中，蒙古族居民長期大量飲用磚茶飲料食品，磚茶由粗老葉和莖加工而成，含氟量非常高，易造成氟骨癥[2]。氟骨癥主要表現(xiàn)為骨關(guān)節(jié)病，以骨硬化為主，并伴有骨質(zhì)疏松和骨間膜改變，形成“地區(qū)性骨質(zhì)疏松”[3]。目前，國內(nèi)治療此類骨質(zhì)疏松一般是藥物治療。在藥物療法中，首選是雌激素替代療法，雖然能減少絕經(jīng)后婦女的骨丟失及骨折發(fā)生率，但同時也增加了患乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的風(fēng)險[4]。所以開發(fā)一類更加安全、有效、可靠的植物類藥已非常迫切了。

骨質(zhì)疏松屬蒙醫(yī)中“骨枯癥”范疇[5]，由于內(nèi)蒙古獨(dú)特的地理和氣候環(huán)境孕育了種類繁多的中蒙藥材資源，例如黃芪、甘草和藍(lán)刺頭等，都具有豐富的藥理作用[6]，在治療骨質(zhì)疏松方面具有副作用小等優(yōu)點[7]。其中藍(lán)刺頭具有植物雌激素樣作用，可通過雌激素樣作用及促進(jìn)骨形成，對骨吸收、骨形成偶聯(lián)有一定調(diào)節(jié)作用，能降低骨轉(zhuǎn)換率，以此達(dá)到防治骨質(zhì)疏松的目的[8]。前期研究發(fā)現(xiàn)通過將黃芪、藍(lán)刺頭等有效部位進(jìn)行不同配比后，其對大鼠骨質(zhì)疏松癥有一定的治療作用[9-10]。因此開發(fā)出了一種高效低毒的蒙藥復(fù)方新藥甘藍(lán)強(qiáng)骨片，用于治療由氟骨癥導(dǎo)致的骨質(zhì)疏松。本實驗通過摘除卵巢建立大鼠骨質(zhì)疏松模型[11]，考察甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠骨質(zhì)疏松模型的治療效果。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗動物與飼養(yǎng)環(huán)境 SPF級Wistar大鼠，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(蒙)2015-0001。

飼養(yǎng)環(huán)境：屏障環(huán)境；溫度：20～26 ℃，日溫差≤3 ℃；相對濕度：41%～64%；換氣次數(shù)：≥15次/h；照明時間：12 h/12 h明暗交替(150～300 Lux)。

1.2 藥品與試劑 甘藍(lán)強(qiáng)骨片(內(nèi)蒙古盛唐國際蒙醫(yī)藥研究有限公司，批號:20200324)；地塞米松磷酸鈉注射液(湖北天藥藥業(yè)有限公司，批號:20190738)；水合氯醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20181124)；羧甲基纖維素鈉(天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號:20190304)。

1.3 主要儀器設(shè)備 電子天平(北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號:BS2202S)；實體解剖顯微鏡(德國Leica公司，型號:DFC 290)；雙能X線骨密度儀(美國GE公司，型號:Dexa Pro-1)；精密電子萬能材料試驗機(jī)(日本島津公司，型號:AGS-J)。

2 方法

1.1 骨質(zhì)疏松模型的建立 Wister大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL·(100 g)-1，大鼠麻醉后，俯臥位固定定于手術(shù)臺上，在腰背部備皮后，分別用酒精、碘酒對皮膚消毒，沿背部腰椎偏正中線向下切開皮膚2 cm左右，再切開肌肉大約1 cm，打開腹腔，用無菌鑷將卵巢夾出，在子宮角上用3號手術(shù)線結(jié)扎輸卵管，剪斷輸卵管，提起呈深粉桑葚狀的卵巢，切除卵巢，縫合腹膜切口。用同樣方法操作對側(cè)，在切口處撒上青霉素鈉凍干粉后縫合肌肉及皮膚切口，術(shù)后肌注2萬單位(U)的青霉素鈉。術(shù)后護(hù)理大鼠3 d，觀察大鼠狀態(tài)，并每天肌注2萬單位(U)的青霉素鈉。

1.2 動物分組與給藥 選取狀態(tài)好的50只Wister大鼠隨機(jī)將其分為模型對照組、甘藍(lán)強(qiáng)骨片0.45、0.90、1.80 g·kg-13個劑量組、雌二醇陽性對照組，另取10只正常大鼠為空白對照組。分組后甘藍(lán)強(qiáng)骨片3個劑量組灌胃給予相應(yīng)濃度的藥物混懸液，20 mL·kg-1，每天1次，連續(xù)15 d。陽性對照組每只大鼠皮下注射雌二醇20 ng·d-1，空白和模型對照組灌胃等容積0.5%羧甲基纖維素鈉。

1.3 指標(biāo)采集及檢測

1.3.1 血清生化指標(biāo)檢測 第15天給藥后30 min，全部大鼠腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g。麻醉后，腹主動脈取血。室溫靜置4 h后，3 000 r·min-1離心30 min，分離血清，置-20 ℃冰箱保存。分別按試劑盒說明書上步驟測定血中無機(jī)鈣、磷、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)含量。

1.3.2 骨密度測定 取大鼠腰椎和左后肢股骨，仔細(xì)剝離附著的肌肉、結(jié)締組織，生理鹽水沖洗后，用生理鹽水潤濕后的紗布包裹，置-20 ℃保存。測定骨密度時置于雙能X線骨密度儀下掃描，測量股骨骨密度。

1.3.3 股骨的干重、灰重測定 左肢股骨測完密度后，置于烘箱105 ℃中烘烤1 h后，冷卻、稱量，記錄各組大鼠股骨干重后，將各組標(biāo)本置于電阻爐中6 h，在干燥器中冷卻至室溫后用電子分析天平測各組灰重。

1.3.4 骨生物力學(xué)檢測 將大鼠右側(cè)股骨置于萬能力學(xué)試驗機(jī)中，進(jìn)行三點彎曲實驗，跨距設(shè)置為14 mm，加載速度為2 mm·min-1，測定最大載荷(N)。

3 結(jié)果

3.1 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對血清生化指標(biāo)的影響 與模型對照組比較，甘藍(lán)強(qiáng)骨片0.45、1.8 g·kg-1劑量組大鼠血鈣水平明顯升高(P<0.05)；1.8 g·kg-1劑量組大鼠血磷水平顯著升高，ALP水平顯著降低(P<0.05)，結(jié)果如表1所示。

表1 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對血清生化指標(biāo)的影響

3.2 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對股骨密度的影響 與模型對照組比較，甘藍(lán)強(qiáng)骨片0.45 g·kg-1劑量組大鼠股骨密度明顯增大(P<0.05)，0.9和1.8 g·kg-1劑量組大鼠股骨密度略有增高，結(jié)果如表2所示。

表2 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對股骨密度的影響

3.3 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對股骨干重和灰重的影響 與模型對照組比較，甘藍(lán)強(qiáng)骨片0.9、1.8 g·kg-1劑量組大鼠股骨干重明顯增加(P<0.05)；甘藍(lán)強(qiáng)骨片0.45、0.9、1.8 g·kg-1劑量組大鼠的股骨灰重均明顯增加(P<0.05)，結(jié)果如表3所示。

表3 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對股骨干重和灰重的影響

3.4 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對骨生物力學(xué)的影響 通過測定股骨最大載荷(N)，考察甘藍(lán)強(qiáng)骨片對骨生物力學(xué)的影響。與模型對照組比較，甘藍(lán)強(qiáng)骨片0.45、0.9 g·kg-1劑量組大鼠股骨最大荷載量明顯增強(qiáng)(P<0.05)，1.8 g·kg-1劑量組最大荷載量差異性不具有顯著性，結(jié)果如表4所示。

表4 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對骨生物力學(xué)檢測的影響

4 討論

由于骨質(zhì)疏松是一種在老年女性中發(fā)病率最高的慢性骨代謝疾病，尤其是在絕經(jīng)后，雌激素水平迅速降低導(dǎo)致骨量流失嚴(yán)重，更容易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，因此我們選擇去卵巢大鼠建立骨質(zhì)疏松模型。而且由于骨質(zhì)疏松病理機(jī)制復(fù)雜，因此需要從生化、骨量、骨生物力學(xué)多個方面系統(tǒng)地考察甘藍(lán)強(qiáng)骨片的藥效學(xué)作用，具體包括以下指標(biāo)：首先，血液中鈣、磷和ALP的含量可以反映骨形成，結(jié)果表明甘藍(lán)強(qiáng)骨片1.80 g·kg-1劑量組大鼠血清中鈣和磷含量改善最佳；其次，通過測量股骨密度、干重和灰重，可以說明骨量的變化程度，其中骨密度是測量是評價骨質(zhì)疏松類藥物療效的必要手段，骨密度越大說明骨質(zhì)量越好。實驗結(jié)果顯示甘藍(lán)強(qiáng)骨片0.45 g·kg-1劑量組提高股骨密度效果最好，而0.90 g·kg-1劑量組對增加大鼠干重和灰重的效果最佳；最后，檢測股骨的最大載荷可以反映骨強(qiáng)度，分析骨骼的結(jié)構(gòu)力學(xué)和材料力學(xué)性質(zhì)。實驗數(shù)據(jù)顯示甘藍(lán)強(qiáng)骨片0.45、0.90 g·kg-1劑量組可以更好地增強(qiáng)股骨的最大載荷。

綜上所述，甘藍(lán)強(qiáng)骨片對去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠的藥效作用，不同的檢測指標(biāo)均表明在該實驗條件下甘藍(lán)強(qiáng)骨片具有抗骨質(zhì)疏松的作用，為藥物的進(jìn)一步開發(fā)研究提供數(shù)據(jù)支持。