花然亮， 徐 鑫， 李素彥， 呂 暢， 李 劍

河北省人民醫(yī)院 急診科，河北 石家莊 050051

嚴(yán)重多發(fā)傷能夠?qū)е聞?chuàng)傷組織功能障礙，易誘導(dǎo)相鄰器官出現(xiàn)繼發(fā)損傷[1]。胃腸道是嚴(yán)重多發(fā)傷后以產(chǎn)生損害的器官之一，對(duì)缺血缺氧敏感，易導(dǎo)致急性胃腸損傷(Acute gastrointestinal injury,AGI)[2]。嚴(yán)重多發(fā)傷后AGI患者臨床主要表現(xiàn)胃潴留和腹內(nèi)高壓等消化系統(tǒng)反應(yīng)。胃腸功能屏障具有保護(hù)腸道功能，屏障受損時(shí)，毒素和病原菌進(jìn)入血液系統(tǒng)，發(fā)生腸道病原菌移位，波及周圍器官，產(chǎn)生繼發(fā)感染。因此，保護(hù)嚴(yán)重多發(fā)傷后AGI患者胃黏膜屏障功能對(duì)于減少多器官衰竭和死亡有重要意義[3]。AGI發(fā)生時(shí)大量炎癥細(xì)胞因子聚集此處，高遷移率族蛋白B1(high mobility group protein B1，HMGB1)是具有保守性的蛋白因子，在多種炎癥刺激下表達(dá)上調(diào)，在炎癥反應(yīng)及腸黏膜屏障損傷中發(fā)揮作用。肺損傷、肝損傷模型大鼠Toll樣受體4(toll likereceptors 4,TLR4)能通過增加中性粒細(xì)胞表達(dá)而加重炎癥損傷[4]。核因子-κB(nuclear facto-κB，NF-κB)能誘發(fā)炎癥反應(yīng)。烏司他丁屬于糖蛋白，具有清除機(jī)體炎癥、減少機(jī)體免疫損傷、保護(hù)人體器官、調(diào)節(jié)機(jī)體平衡的作用，臨床應(yīng)用于急性胰腺炎、創(chuàng)傷性休克，同樣也應(yīng)用外科手術(shù)及腫瘤治療中減少腎功能損傷[5]。烏司他丁能夠改善腦出血AGI患者腸黏膜功能，緩解病情，但在嚴(yán)重多發(fā)傷合并AGI中對(duì)腸道屏障及HMGB1/TLR4/NF-κB通路的影響研究較少。本研究旨在探討烏司他丁基于HMGB1/TLR4/NF-κB通路對(duì)急性胃腸損傷家兔腸屏障功能的保護(hù)機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 烏司他丁購自常州天普制藥有限公司(國(guó)藥準(zhǔn)字：H19990131)，丙氨酰谷氨酰胺購自珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)生物化學(xué)制藥廠(國(guó)藥準(zhǔn)字：H20060344)，兔抗鼠 HMGB1、TLR4、NF-κB抗體購自美國(guó) Santa Cruz 公司，多聚甲醛購自濟(jì)南創(chuàng)世化工，生化實(shí)驗(yàn)電泳蛋白儀購自中國(guó)上海知信，Leica VT1000 S振動(dòng)式切片機(jī)購自北京悅昌行科技。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與建模 家兔40只，購自中國(guó)重慶威斯騰生物，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，3～5月齡，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物規(guī)則飼養(yǎng)2周。動(dòng)物一般情況及精神狀態(tài)良好，設(shè)對(duì)照組10只，其余30只建立模型，建模前禁食12 h，禁飲6 h。自行設(shè)計(jì)重力牽引模仿交通意外導(dǎo)致?lián)p傷，家兔采用1.5%戊巴比妥納進(jìn)行耳緣靜脈麻醉，固定于碰撞車后座椅之上，單軌時(shí)進(jìn)行對(duì)撞損傷，雙軌時(shí)進(jìn)行側(cè)撞損傷。保持自然坐姿，啟動(dòng)模擬損傷。損傷后立即送至動(dòng)物檢查室，采用CT對(duì)動(dòng)物創(chuàng)傷程度進(jìn)行評(píng)估，對(duì)照組不參與損傷建模。對(duì)家兔嚴(yán)重多發(fā)傷6 h后進(jìn)行AGI評(píng)估，評(píng)估參照《歐洲危重病醫(yī)學(xué)會(huì)關(guān)于AGI的定義和處理指南(2012)》[5-6]，家兔全部建模成功。將30只建模動(dòng)物分為損傷組、藥物對(duì)照組和干預(yù)組，每組10只。藥物對(duì)照組建模成功后腹腔注射1.2 /kg的丙氨酰谷氨酰胺，8 h一次，連續(xù)7 d；干預(yù)組腹腔注射10萬U/kg的烏司他丁，8 h一次，連續(xù)7 d。其余家兔同部位注射等體積生理鹽水。

圖1 各組小腸病理形態(tài)比較(HE染色×200；a.對(duì)照組；b.損傷組；c.藥物對(duì)照組；d.干預(yù)組)

1.3 觀察指標(biāo) 最后一天注射后，檢查4組家兔的腸脂肪酸結(jié)合蛋白(intestinal fatty acid binding protein，IFABP)、二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)、D 乳酸(D-Lactate，D-Lac)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)及C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)。比較丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase，SOD)等血清氧化應(yīng)激指標(biāo)。

1.4 標(biāo)本提取及免疫印跡檢測(cè) 血液指標(biāo)檢測(cè)完成后，耳緣靜脈空氣栓處死家兔，無菌條件下，取回盲部15～20 cm組織，石蠟切片5 μm后，除蠟處理進(jìn)行乙醇脫水。蘇木精染色沖洗3次后，伊紅染色5 min，顯微鏡觀察腸道組織形態(tài)。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)小腸組織HMGB1、TLR4、NF-κBmRNA 小腸組織加入胰蛋白裂解液，離心后采取上清液加入樣孔。進(jìn)行電泳，緩釋劑及磷酸鹽緩沖溶液處理后，分別加入兔抗鼠1抗HMGB1(1∶600)、TLR4(1∶800)及NF-κB(1∶600 )，24 h后加入抗兔免疫球蛋白G二抗(1∶1 000)，雜交5 min采用磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次后檢測(cè)，獲取圖象，目的基因以β-actim為內(nèi)參。各組小腸組織進(jìn)行裂解，提取細(xì)胞重懸液，沖洗后放于無菌試管管中，采用TRIzol試劑提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為DNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增。反應(yīng)條件：98℃ 6 min，98℃28 s，75℃ 30 s，80℃ 4 min，總計(jì)55個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 各組血清腸黏膜屏障及炎癥指標(biāo)比較 3組進(jìn)行對(duì)撞損傷的家兔血清腸黏膜屏障指標(biāo)IFABP、DAO、D-Lac和炎癥指標(biāo)PCT、CRP均高于對(duì)照組，藥物對(duì)照組和干預(yù)組的上述指標(biāo)均低于損傷組，且干預(yù)組低于藥物對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組血清腸黏膜屏障及炎癥炎癥比較

2.2 各組血清MDA、SOD水平比較 3組進(jìn)行對(duì)撞損傷的家兔血清MDA高于對(duì)照組，藥物對(duì)照組和干預(yù)組的MDA均低于損傷組，且干預(yù)組MDA低于藥物對(duì)照組；3組進(jìn)行對(duì)撞損傷的家兔血清SOD低于對(duì)照組，藥物對(duì)照組和干預(yù)組的SOD均高于損傷組，且干預(yù)組SOD高于藥物對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組血清MDA、SOD比較

2.3 各組家兔小腸病理形態(tài)比較 對(duì)照組，小腸絨毛上皮及隱窩結(jié)構(gòu)正常，絨毛致密，未見炎癥浸潤(rùn)。損傷組，腸絨毛腫脹、脫落及水腫，小腸隱窩存在，黏膜下大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。藥物對(duì)照組，腸絨毛腫脹減輕，水腫好轉(zhuǎn)，黏膜下浸潤(rùn)減輕。干預(yù)組，腸絨毛數(shù)量增多，長(zhǎng)度增高，腺體增多，隱窩恢復(fù)正常。見圖2。

圖2 各組家兔HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)

2.4 各組HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白及mRNA表達(dá) 3組進(jìn)行對(duì)撞損傷的家兔HMGB1、TLR4、NF-κB等蛋白及mRNA均高于對(duì)照組，藥物對(duì)照組和干預(yù)組的上述指標(biāo)均低于損傷組，且干預(yù)組低于藥物對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表4。

表4 各組HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白及mRNA比較

3 討論

嚴(yán)重多發(fā)傷是一種死亡率較高的急危重癥，治療過程中常伴機(jī)體感染，誘發(fā)多器官功能不全。當(dāng)發(fā)生嚴(yán)重多發(fā)傷時(shí)，胃腸急性缺氧、缺血癥狀顯著，是易受到損傷的器官之一。嚴(yán)重多發(fā)傷可合并產(chǎn)生AGI，胃腸功能損傷，影響患者預(yù)后[6]。谷氨酰胺是人體必需氨基酸，能夠顯著提高AGI患者胃腸道黏膜功能，為應(yīng)激狀態(tài)下的腸黏膜細(xì)胞提供必需的能量，促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞增殖，為分泌型免疫球蛋白的漿細(xì)胞提供能量，減少腸道細(xì)菌對(duì)腸黏膜的附著，保護(hù)腸道免疫系統(tǒng)功能，減少腸黏膜細(xì)胞的過度凋亡，保護(hù)腸黏膜上皮形態(tài)完整。

IFABP與機(jī)體腸道黏膜功能密切相關(guān)，屬于分子量較低的胞液蛋白，在全身代謝運(yùn)轉(zhuǎn)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。IFABP在腸黏膜中表達(dá)較為豐富，但黏膜層對(duì)缺氧缺血較為敏感，當(dāng)發(fā)生AGI時(shí)，炎癥細(xì)胞聚集腸道黏膜下層，IFABP早期釋放表達(dá)上調(diào)，增加腸道細(xì)胞膜通透性，大分子物質(zhì)穿過細(xì)胞膜損傷腸道黏膜屏障功能，通過檢測(cè)血清IFABP能夠提高診斷AGI的準(zhǔn)確性[7]。在正常機(jī)體中，DAO表達(dá)極低，AGI大鼠機(jī)體腸黏膜功能降低，DAO在腸道黏膜中表達(dá)下調(diào)，而隨著壞死細(xì)胞進(jìn)入腸道內(nèi)，導(dǎo)致腸道組織中DAO含量升高，其活性變化可作為早起檢測(cè)AGI患者腸黏膜損傷有效指標(biāo)之一[8]。在AGI患者血清D-Lac表達(dá)升高，主要聚集在腸道，腸黏膜損傷后，屏障功能降低，D-Lac表達(dá)升高能夠較好反應(yīng)腸黏膜通透性改變情況。AGI不僅能夠?qū)е履c黏膜功能降低，還誘發(fā)全身炎癥指標(biāo)增加。PCT在機(jī)體受到外環(huán)境內(nèi)毒素和病原菌侵犯時(shí)，含量升高誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)。CRP屬于非特異性炎癥標(biāo)志因子，能夠參與機(jī)體多個(gè)疾病發(fā)生、發(fā)展。在AGI患者血清內(nèi)表達(dá)上調(diào)，在腸道損傷部位聚集，降低黏膜屏障功能。AGI疾病氧化還原系統(tǒng)存在紊亂，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞抗氧化能力降低，增加DNA損傷。AGI大鼠中存在MDA、SOD水平異常表達(dá)，MDA表達(dá)升高，SOD水平降低[9]。烏司他丁具能夠顯著清除內(nèi)源性氧化應(yīng)激，具有保護(hù)黏膜屏障功能作用。機(jī)制在于能夠通過抑制糖等脂類水解，穩(wěn)定黏膜結(jié)構(gòu)[10]。初期AGI患者黏膜出現(xiàn)存在不同程度缺血，烏司他丁治療后血清中腸黏膜屏障指標(biāo)IFABP、DAO、D-Lac表達(dá)降低，采用黏膜高通透性狀態(tài)，具有保護(hù)黏膜屏障功能作用[11]。烏司他丁是能抑制炎癥細(xì)胞內(nèi)活性物質(zhì)的糖蛋白，減少PCT、CRP對(duì)腸道黏膜的損傷，改善氧化損傷[12]。有研究表明，烏司他丁能夠遏制PCT、CRP表達(dá)而緩解急性胃腸損傷病情。本研究表示，藥物對(duì)照組和干預(yù)組血清腸黏膜屏障指標(biāo)物和炎癥指標(biāo)均降低，干預(yù)組效果更顯著，說明烏司他丁可以保護(hù)腸黏膜屏障功能[13]。

HMGB1是高度保守性的核蛋白，參與細(xì)胞DNA重組及修復(fù)[14]。AGI損傷后，HMGB1隨腸上皮細(xì)胞的脫落分泌到細(xì)胞外，發(fā)揮促炎作用[15]。AGI疾病大鼠內(nèi)毒素表達(dá)升高，提高HMGB1釋放，與TLR4結(jié)合，加快NF-κB磷酸化，激活HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA信號(hào)通路表達(dá)。AGI患者TLR4能夠激活TAK信號(hào)通路，介導(dǎo)細(xì)胞因子釋放，參與腸道黏膜損傷，誘導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)[16]。AGI大鼠腸道組織中NF-κB表達(dá)上調(diào)，腸道缺血缺氧能夠激活NF-κB，加重感染。有研究表明，NF-κB及下游細(xì)胞因子表達(dá)激活能夠加快腸黏膜損傷，增加細(xì)菌移位，與腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷存在正相關(guān)[17]。有研究表明，在AGI大鼠腸道組織中發(fā)現(xiàn)HMGB1、TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)升高，與健康大鼠相比，該信號(hào)通路能夠通過介導(dǎo)炎癥及氧化應(yīng)激指標(biāo)參與黏膜損傷[18]。烏司他丁臨床廣泛用于抗燒傷及休克，，本研究干預(yù)組采用烏司他丁灌胃后腸道組織中HMGB1、TLR4、NF-κBmRNA表達(dá)降低，其機(jī)制可能在于烏司他丁抑制腸道細(xì)胞因子活性，降低IFABP、DAO、D-Lac等指標(biāo)對(duì)腸黏膜的損傷，降低氧化刺激，下調(diào)HMGB1、TLR4、NF-κB mRNA表達(dá)，從而改善機(jī)體損傷。這與相關(guān)研究結(jié)果類似[19-20]。

綜上所述，烏司他丁能夠提高AGI家兔腸屏障功能，改善炎癥及應(yīng)激，其作用機(jī)制與抑制HMGB1/TLR4/NF-κB通路相關(guān)。