姜水兵，努爾麥麥提·麥麥提敏

（塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

圓環(huán)病毒在近些年備受獸醫(yī)界的關(guān)注，圓環(huán)病毒科成員在顆粒形態(tài)及基因組方面均類(lèi)似，但是在生態(tài)學(xué)、生物學(xué)、抗原性等方面差異比較大。關(guān)于鴨圓環(huán)病毒（DuCV）報(bào)道最早于2003年由德國(guó)學(xué)者Hattermann等［1］報(bào)道，隨后2004年德國(guó)［2］、2005年匈牙利［3］也相繼報(bào)道，自2007年起，在山東、江蘇、四川、福建、廣東、浙江、遼寧、重慶等省份陸續(xù)有鴨群感染DuCV報(bào)道［4］，DuCV感染后不僅可使鴨發(fā)生原發(fā)性感染，還會(huì)使鴨免疫系統(tǒng)受到損害，易遭受其他細(xì)菌和病毒的并發(fā)或繼發(fā)感染，給全球養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［5］。因?yàn)镈uCV在動(dòng)物細(xì)胞和禽胚上的增殖培養(yǎng)方法尚未建立，故無(wú)法采用傳統(tǒng)的病毒分離鑒定方法進(jìn)行準(zhǔn)確診斷，而根據(jù)流行病學(xué)、臨床癥狀、病理變化等也只能做出初步診斷，確診需借助實(shí)驗(yàn)室診斷方法。

楊曉偉等［6］研究發(fā)現(xiàn)鴨圓環(huán)病毒病在川渝地區(qū)存在低水平感染。廣西同時(shí)存在基因1.1亞型、基因1.2亞型和基因2.1亞型3種不同的DuCV毒株流行，其中基因1.1亞型和1.2亞型為優(yōu)勢(shì)流行毒株［7］。江西部分地區(qū)鴨圓環(huán)病毒病的流行較為嚴(yán)重，且優(yōu)勢(shì)基因型為1型［8］。由于DuCV常以隱性感染形式存在，易被忽視，從而為DuCV的傳播、適應(yīng)與變異提供了更多機(jī)會(huì)。為明確DuCV在和田地區(qū)的感染與流行情況，本研究對(duì)和田地區(qū)疑似發(fā)病鴨群進(jìn)行了DuCV的檢測(cè)與全基因組測(cè)序分析，旨在了解DuCV流行毒株在和田地區(qū)的遺傳變異情況和流行優(yōu)勢(shì)基因型，為和田地區(qū)防控DuCV提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品的采集 采自和田地區(qū)5個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)15～30日齡的櫻桃谷肉鴨，出現(xiàn)被羽脫落，生長(zhǎng)遲緩等癥狀共100例病、死鴨樣品，無(wú)菌收集包括肝、脾、法氏囊等組織臟器，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑 主要試劑：DNA zol、ExTaq酶、DNA Marker DL 2000，北京全式金生物技術(shù)有限公司；Gold View，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；pMD18-T Vector，寶生物工程（大連）有限公司；E.coliDH5α株感受態(tài)細(xì)胞，天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA提取 將采集的肝、脾、法氏囊等器官組織樣品使用消毒過(guò)的手術(shù)剪各剪取黃豆大小的組織塊，將剪取的組織塊倒入加有5倍體積生理鹽水的研磨器中進(jìn)行研磨，研磨后的組織液反復(fù)凍融3次，4℃8 000 r/min離心5 min，取上清并做好標(biāo)記保存?zhèn)溆?。處理好的樣品按照DNA zol試劑盒操作說(shuō)明書(shū)提取病毒DNA。

1.2.2 引物合成 楊育鵬［9］發(fā)表的DuCV-1、DuCV-2特異性引物，DuCV-F：5'-CGACTTATGTTATCT TTGGGCGT-3'，DuCV-1R：5'-AATTCTGCGGTACA GAGA（C）TGA-3'，DuCV-2R：5'-AGCCTCAGAAA ACCAGATAATGCG-3'，其中DuCV-F為DuCV基因型的共用上游引物，與DuCV-1R特異性擴(kuò)增長(zhǎng)度為398 bp，與DuCV-2R特異性擴(kuò)增長(zhǎng)度為811 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 DuCV雙重PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序 PCR體系為25μL，其中模板DNA 2μL，上游引物0.5μL，下游引物各0.25μL，EasyTaqMix12μL，ddH2O10μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸補(bǔ)齊5 min，以陽(yáng)性樣本和ddH2O分別作陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照。PCR產(chǎn)物取5μL經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果，陽(yáng)性產(chǎn)物經(jīng)膠回收，連接到pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化宿主菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)培養(yǎng)篩選，挑取單個(gè)轉(zhuǎn)化菌落于LB培養(yǎng)液（Amp+）過(guò)夜培養(yǎng)，PCR鑒定陽(yáng)性克隆菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用DNAStar進(jìn)行拼接分析。

1.2.4 DuCV基因組序列分析 運(yùn)用DNAStar7和Mega5對(duì)所獲得的和田毒株與GenBank中10個(gè)國(guó)內(nèi)外DuCV毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析和同源性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 DuCV基因組PCR擴(kuò)增結(jié)果

從鴨組織中提取總病毒DNA后用合成的特異性引物進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)瓊脂凝膠電泳，通過(guò)全自動(dòng)凝膠成像分析儀中觀察到了398 bp目的片段（圖1），未出現(xiàn)811 bp片段。

圖1 鴨圓環(huán)病毒PCR檢測(cè)結(jié)果

2.2 DuCV基因部分序列同源性分析

測(cè)序結(jié)果通過(guò)應(yīng)用DNAStar軟件中的SeqMan對(duì)序列拼接，獲得4株DuCV部分基因序列，選取一株DuCV基因部分序列以MN068360.1為目標(biāo)序列，選取11株國(guó)內(nèi)外參考基因，其中與源自山東MN068358.1、臺(tái)灣KP229369.1、韓國(guó)KC851821.1同源性為100%，與韓國(guó)JQ740360.1、中國(guó)KC460533.1、廣西MK814581.1同源性為99.3%（表1、圖2）。

表1 參考DuCV毒株信息

圖2 參考DuCV毒株部分序列構(gòu)建的同源性對(duì)比

2.3 DuCV部分基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

采用MEGA軟件將目標(biāo)基因與11株參考序列繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，由進(jìn)化樹(shù)可知，本試驗(yàn)獲得的毒株與源自山東的MN068358關(guān)系較近，屬于同一分支，與源自福建的GQ423740關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。

圖3 參考DuCV毒株部分序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.4 DuCV與鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒混合感染情況

經(jīng)過(guò)對(duì)所有樣本進(jìn)行PCR或RT-PCR檢測(cè)，在20份DuCV陽(yáng)性樣本中，鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒的陽(yáng)性率分別為10.00%（2/20）、30.00%（12/20）、5.00%（1/20）。剩余80份DuCV陰性樣本中，鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒的陽(yáng)性率分別為8.75%（7/80）、25.00%（20/80）、3.75%（3/80）。結(jié)果顯示，DuCV陽(yáng)性樣品中鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒感染率均略高于DuCV陰性樣本（表2）。

表2 DuCV陽(yáng)性或者陰性樣品中鴨肝炎病毒、鴨出血病毒及呼腸孤病毒混合感染情況

3 小結(jié)與討論

自2003年德國(guó)學(xué)者Hattermann等［1］首次報(bào)道鴨圓環(huán)病毒以來(lái)，世界各地相繼報(bào)道其流行病學(xué)。本試驗(yàn)采集和田地區(qū)5個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)共100例病、死鴨樣品進(jìn)行鴨圓環(huán)病毒檢測(cè)，結(jié)果表明，2021年采集的和田部分地區(qū)病、死鴨樣品DuCV陽(yáng)性檢出率為20%，且優(yōu)勢(shì)流行毒株為DuCV-1，低于高攀攀等［10］2020年采集的山東省部分地區(qū)DuCV陽(yáng)性檢出率，同時(shí)與中國(guó)臺(tái)灣、匈牙利等地的DuCV感染率也有一定差異，說(shuō)明DuCV感染呈現(xiàn)地域差異性。

DuCV陽(yáng)性樣本與陰性樣本中鴨肝炎病毒、鴨出血病毒及呼腸孤病毒混合感染的情況顯示，DuCV陽(yáng)性樣本中鴨肝炎病毒、鴨出血病毒、呼腸孤病毒感染率均略高于DuCV陰性樣本，表明DuCV病毒在侵入機(jī)體造成免疫損害后，易與其他病原微生物共染。

從DuCV毒株部分基因序列進(jìn)化樹(shù)分析，和田流行優(yōu)勢(shì)毒株與源自山東毒株關(guān)系最近，可能由于市場(chǎng)交易造成病原傳播。和田養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)屬于國(guó)家扶持產(chǎn)業(yè)，種鴨、種蛋均由浙江大型養(yǎng)鴨場(chǎng)提供，建議養(yǎng)殖場(chǎng)在選擇引進(jìn)適合本地養(yǎng)殖種鴨品種與種蛋的同時(shí)，做好種鴨疫病檢測(cè)、種蛋病原凈化；加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，改善飼養(yǎng)環(huán)境，使用中草藥混合飼料，提高鴨群對(duì)疾病的抵抗力；做好DuCV-1型疫苗接種，定期檢測(cè)抗體水平。