余淑艷， 周燕飛， 黃 薇， 王 星， 高雪芹， 伏兵哲，3*

(1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 寧夏 銀川 750021； 2.寧夏大學(xué)西北土地退化與生態(tài)恢復(fù)國家重點實驗室培育基地， 寧夏 銀川 750021； 3.寧夏優(yōu)勢特色作物現(xiàn)代分子育種重點實驗室， 寧夏 銀川 750021)

干旱和鹽害是影響植物生長和生產(chǎn)力的2個主要非生物脅迫因子。尤其在干旱、半干旱地區(qū)由于土壤水分蒸發(fā)量遠(yuǎn)大于降水量，造成土壤溶液濃縮鹽分濃度升高，形成鹽害與干旱雙重脅迫[1]，干旱脅迫和鹽脅迫不僅影響植物的生長，而且兩者互作導(dǎo)致土壤溶液水勢下降而使植物細(xì)胞失水甚至死亡[2]，對牧草的生長發(fā)育造成很大的傷害。沙蘆草(Agropyronmongolicum)又稱蒙古冰草，為禾本科小麥族冰草屬多年生草本植物[3]，有抗旱、耐鹽、抗風(fēng)沙的特性，是重要的牧草資源和抗旱性改良的寶貴基因資源[4]。沙蘆草作為冰草屬代表植物，具有重要的飼用價值、遺傳價值和生態(tài)價值[5]，因此鑒定并了解苗期沙蘆草在干旱和鹽害下的耐受機制對生態(tài)系統(tǒng)保護具有重要意義。

干旱和鹽害會降低植物吸收水分的能力，造成“生理干旱”，并且迅速導(dǎo)致生長速率降低，以及一系列生理代謝變化，例如滲透脅迫、氧化損傷、氣孔封閉、抑制光合作用、降低氣體交換率等[6]。但目前旱鹽復(fù)合脅迫對植物影響的研究大多集中在小麥(TriticumaestivumL.)等大宗作物上，如翁亞偉等研究發(fā)現(xiàn)小麥在鹽旱復(fù)合脅迫下表現(xiàn)出適應(yīng)性，原因是維持了較高的水分吸收和降低Na+/K+比率[7]。劉建新等[8]研究發(fā)現(xiàn)適量的土壤含鹽量可緩解輕、中度干旱脅迫對燕麥(AvenasativaL.)幼苗的傷害，而重度鹽脅迫會加重干旱對燕麥幼苗的損傷。陳成升等[9]通過研究旱鹽復(fù)合對冬小麥(T.aestivumL.)生長影響，發(fā)現(xiàn)在干旱脅迫條件下，適量鹽分能夠減輕干旱脅迫對冬小麥造成的傷害。目前對于沙蘆草的脅迫研究僅限于干旱[10-13]和鹽害[14]，在旱鹽復(fù)合脅迫方面的研究相對較少。

因此，本研究以‘鹽池’沙蘆草品種為材料，通過盆栽試驗?zāi)M干旱、鹽和旱鹽復(fù)合3種逆境脅迫，分析沙蘆草的生長、光合和生理效應(yīng)等指標(biāo)對逆境脅迫的響應(yīng)，為揭示沙蘆草抗旱耐鹽調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2019年在寧夏大學(xué)農(nóng)科學(xué)生實訓(xùn)基地智能溫室和草業(yè)科學(xué)實驗室進行。試驗開始時將‘鹽池’沙蘆草種子種植在高15 cm，口徑20 cm的圓形花盆中，每盆裝土1.0 kg，出苗10 cm高時，每盆定苗5株。試驗設(shè)置4個處理，分別為：對照CK(正常供水，土壤含水量為田間最大持水量的75%)、干旱D(土壤含水量為田間最大持水量的35%)、鹽S(土壤含水量為最大持水量的75%，土壤含鹽量0.4%)和旱鹽復(fù)合DS(土壤含水量為田間最大持水量的35%，土壤含鹽量0.4%)，其中干旱脅迫程度參照Hsiao[15]和黎裕[16]的方法進行劃分，鹽脅迫以NaCl水溶液形式施入土壤，施入量按照每盆土樣干重的0.4%計算，每處理設(shè)置3次重復(fù)，每個重復(fù)20盆。苗高15 cm左右，開始脅迫處理，脅迫保持7 d后測定相關(guān)指標(biāo)。

1.2 測定項目與方法

1.2.1生長指標(biāo)測定 每個處理隨機選取10株相同部位的葉片，利用LI-3100C葉面積儀測定葉長(Leaf length，LL)、葉寬(Leaf width，LW)和葉面積(Leaf area，LA)。每個處理隨機取20株，將根系在去離子水中沖洗干凈，吸水紙吸干根系表面水分，用全自動根系掃描分析儀對各處理下的根系進行掃描，掃描時將根系放入根系掃描儀自帶的透明托盤內(nèi)，加入3～5 mL水以避免根系分支的互相纏繞。掃描后保存圖像，采用WinRhizo Pro Vision 5.0a分析軟件對圖像進行分析，統(tǒng)計根長度、根面積、根表面積及根投影面積等。

1.2.2葉綠素含量與熒光參數(shù)測定 在早上9∶00-11∶00，每個處理選取20株，植株上部相同部位的葉片，用便攜式葉綠素?zé)晒鈨xPAM-2500測定PS II的最大光化學(xué)效率(Maximal photochemical efficiency，F(xiàn)v/Fm)，每個葉片測定3次。由ImagingWin軟件自動完成，記錄，存儲和呈現(xiàn)Fv/Fm的彩色圖像。

1.2.3光合參數(shù)測定 選擇晴朗的早晨9∶00-11∶00，每個處理隨機取7株相同部位葉片，利用Li-6400便攜式光合儀測定凈光合速率(Net photosynthetic rate,Pn)、胞間CO2濃度(Intercellular CO2concentration,Ci)、氣孔導(dǎo)度(Stomatal conductance,Gs)和蒸騰速率(Transpiration rate,Tr)。

1.2.4生理特性測定 葉片相對含水量采用烘干法[17]，于上午植株露水蒸發(fā)后進行取樣，取3葉稱取鮮重(M1)，浸入去離子水中12 h至恒重稱重(M2)，然后置于烘箱中105℃殺青1 h，85℃烘干48 h至恒重(M0)，按照公式計算葉片相對含水量：葉片相對含水量=(M1-M0)/(M2-M0)×100%。

可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定[18]；可溶性蛋白質(zhì)含量采用考馬斯亮藍法測定[19]；游離脯氨酸含量采用茚三酮顯色法測定[20]；金屬離子Na+，K+含量采用比色法測定；葉片丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid,TBA)測定[21]；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性采用氮藍四唑光還原法測定[22]，過氧化物酶POD活性采用愈創(chuàng)木酚顯色法測定[23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)運用Excel 2016進行初步處理，用DPS 7.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及方差分析，并用Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草生長指標(biāo)的影響

由表1可知，沙蘆草株高、葉寬、葉面積和根直徑在鹽脅迫下比對照顯著升高(P<0.05)，在干旱脅迫下葉長、根表面積和根投影面積比對照顯著降低(P<0.05)；旱鹽復(fù)合脅迫下，沙蘆草根表面積和投影面積均顯著低于對照(P<0.05)，葉面積和根直徑顯著高于對照(P<0.05)；其它各生長指標(biāo)在3種脅迫處理下，與對照無顯著差異；3種脅迫中,干旱脅迫對沙蘆草生長指標(biāo)的影響最明顯，旱鹽復(fù)合脅迫次之，鹽脅迫最輕。

2.2 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草葉綠素含量和熒光參數(shù)的影響

由圖1所示，與對照相比，沙蘆草的葉綠素含量在干旱與旱鹽復(fù)合脅迫下呈下降趨勢；PSII最大光合效率Fv/Fm和PSII實際光合效率Y(II)在干旱和旱鹽復(fù)合脅迫下比對照顯著下降(P<0.05)，F(xiàn)v/Fm在干旱和旱鹽復(fù)合脅迫下分別降低了12.62%和9.92%，Y(II)在干旱和旱鹽復(fù)合脅迫下分別降低了12.08%和9.94%，但干旱脅迫和旱鹽復(fù)合脅迫之間無顯著差異；說明干旱脅迫與復(fù)合脅迫造成沙蘆草幼苗的光合機構(gòu)損傷，從而影響葉綠素?zé)晒獾淖兓?；鹽脅迫下的葉綠素含量、Fv/Fm和Y(II)與對照相比呈上升趨勢，進一步說明鹽脅迫對沙蘆草的光合機構(gòu)不會造成破壞，沙蘆草具有一定的耐鹽性。

表1 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草生長指標(biāo)的影響Table1 Effects of drought,salt and drought-salt combined stress on A. mongolicum growth indexes

圖1 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草葉綠素含量與熒光參數(shù)的影響Fig.1 Effects of drought,salt and drought-salt combined stress on chlorophyll content and fluorescence parameters of A. mongolicum注：圖A,葉綠素含量；圖B,PSII最大光合效率Fv/Fm；圖C,PSII實際光合效率Y(II)；CK,對照；D,干旱脅迫；S,鹽脅迫；DS,旱鹽復(fù)合脅迫，下同Note:Fig. A,Chlorophyll content;Fig. B,PSII maximum photosynthetic efficiency Fv/Fm;Fig. C,PSII actual photosynthetic efficiency Y(II);CK,Control;D,Drought stress;S,Salt stress;DS,Drought-salt Combined stress,the same as below

2.3 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草幼苗光合特性的影響

如圖2所示，沙蘆草氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率在鹽脅迫下比對照分別顯著升高了59.27%和33.24%(P<0.05)，干旱脅迫和旱鹽復(fù)合脅迫下無顯著變化；3種脅迫處理下，凈光合速率與對照之間均存在顯著差異(P<0.05)；胞間CO2濃度在干旱與旱鹽復(fù)合脅迫下顯著低于對照(P<0.05)，鹽脅迫下無顯著差異；由此可見，3種逆境脅迫下，干旱脅迫對沙蘆草的凈光合速率和胞間CO2濃度的影響最大，旱鹽復(fù)合脅迫次之，鹽脅迫最小。

圖2 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草葉片光合作用的影響Fig.2 Effects of drought,salt and drought-salt combined stress on photosynthesis in the leaves of A. mongolicum

2.4 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草葉片相對含水量的影響

逆境脅迫下，葉片相對含水量可以反映植物抗逆性。不同脅迫處理對沙蘆草葉片相對含水量的影響如圖3所示。干旱脅迫和旱鹽復(fù)合脅迫下，沙蘆草葉片相對含水量比對照減少了13.10%和13.33%(P<0.05)，干旱脅迫和旱鹽復(fù)合脅迫之間無顯著差異；在鹽脅迫下，葉片相對含水量較高，但與對照之間無顯著差異，由此可見一定濃度的鹽分有利于維護沙蘆草葉片的生長，表明沙蘆草具有一定的耐鹽性。

圖3 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草葉片相對含水量的影響Fig.3 Effects of drought,salt and drought-salt combined stress on relative water content in leaves of A. mongolicum

2.5 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草葉片抗氧化酶活性的影響

植物主要通過抗氧化性酶來消除活性氧對植物的破壞。3種脅迫下，沙蘆草葉片SOD活性變化與對照無顯著差異；POD活性比對照顯著升高(P<0.05)，其中鹽脅迫POD活性>干旱脅迫>旱鹽復(fù)合脅迫(圖4)。

圖4 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草葉片抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effects of drought,salt and drought-salt combined stress on antioxidant enzyme activities in leaves of A. mongolicum

2.6 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草葉片丙二醛(MDA)含量的影響

沙蘆草葉片MDA含量在干旱脅迫與旱鹽復(fù)合脅迫下比對照顯著增加(P<0.05)，但在鹽脅迫下，與對照無顯著變化。其中旱鹽復(fù)合脅迫下的MDA含量>干旱脅迫>鹽脅迫。說明旱鹽復(fù)合脅迫顯著加重了沙蘆草的膜脂過氧化作用(圖5)。

2.7 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

如圖6所示，在鹽脅迫下，與對照相比，沙蘆草葉片可溶性蛋白質(zhì)含量和游離脯氨酸含量顯著升高(P<0.05)，分別提高了40.14%和25.33%，可溶性糖含量在鹽脅迫下與對照相比顯著降低(P<0.05)，下降了36.62%；干旱脅迫與旱鹽復(fù)合脅迫下，沙蘆草可溶性蛋白質(zhì)含量、游離脯氨酸含量和可溶性糖含量與對照相比明顯升高但無顯著差異；3種脅迫處理對葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響為：干旱脅迫>旱鹽復(fù)合脅迫>鹽脅迫。

圖5 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草葉片丙二醛(MDA) 含量的影響Fig.5 Effects of drought,salt and drought-salt combined stress on MDA content in leaves of A. mongolicum

圖6 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響Fig.6 Effects of drought,salt and drought-salt combined stress on the content of osmotic adjustment substances in the leaves of A. mongolicum

2.8 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草根系和葉片的Na+，K+以及Na+/K+之比的影響

由表2可知，3種逆境脅迫下，沙蘆草根系Na+和K+含量與對照之間無顯著差異，Na+/K+比值均顯著高于對照(P<0.05)，各處理之間無顯著差異；3種脅迫下，與對照相比，沙蘆草葉片中Na+含量和Na+/K+比顯著增加(P<0.05)，而K+含量與對照相比無顯著變化；3種逆境脅迫對沙蘆草葉片中Na+，K+含量以及Na+/K+比的影響大于根系。

表2 干旱、鹽及旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草幼苗根系與葉片的Na+，K+離子及Na+/K+離子比的影響Table 2 Effects of drought,salt and drought-salt combined stress on the ratio of Na+，K+and Na+/K+ratio in roots and leaves of A. mongolicum seedlings

3 討論

干旱環(huán)境導(dǎo)致植物吸水困難，造成生理性缺水，使植物生長受到抑制[24]。本試驗結(jié)果表明，干旱、鹽以及旱鹽復(fù)合脅迫下，沙蘆草部分生長指標(biāo)較對照均有顯著差異，其中干旱脅迫影響最明顯，旱鹽復(fù)合脅迫影響次之，鹽脅迫影響最小(表1)；鹽脅迫下，沙蘆草株高、葉寬、葉面積和根直徑較對照顯著升高，說明沙蘆草具有一定的耐鹽性；干旱脅迫下，沙蘆草葉長、根表面積和根投影面積等指標(biāo)與對照相比均顯著降低(表1)，表明干旱抑制沙蘆草幼苗生長，在干旱脅迫下沙蘆草通過根系變化來適應(yīng)脅迫環(huán)境，這與馬艷紅等[25]在干旱脅迫下對沙蘆草苗期的研究和劉凱強等[26]在干旱脅迫下對燕麥器官生長的研究結(jié)果一致，在旱鹽復(fù)合脅迫處理后明顯增加，可見，旱鹽復(fù)合脅迫下沙蘆草幼苗表現(xiàn)出一定的交叉適應(yīng)性，這與陳春曉等[27]對鹽分和干旱下沙棗(ElaeagnusangustifoliaL.)幼苗生理特性的影響的研究結(jié)果相似。

旱鹽復(fù)合脅迫對植物的光合作用具有重要影響，而葉綠素含量則是決定光合作用強弱的重要因素之一，PSⅡ最大光合效率(Fv/Fm)和實際光合效率Y(II)是衡量植物光合作用受抑制程度的重要指標(biāo)[28-29]，凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、氣孔蒸騰速率和胞間CO2濃度是衡量光合作用的重要參數(shù)。本試驗結(jié)果表明，干旱脅迫下，沙蘆草凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率和胞間CO2濃度均呈下降趨勢(圖2)，說明葉片在逆境脅迫條件下保持自身正常的生理代謝，通常通過降低氣孔導(dǎo)度的方式來減少葉片中蒸騰作用和水分散失，在水分散失的同時氣孔導(dǎo)度的降低也限制了CO2的吸收，間接導(dǎo)致凈光合速率的降低，這與魏清江等[30]在干旱復(fù)水對柑橘(CitrusreticulataBlanco)幼苗葉片光合作用的研究相似。周朝彬等[31]通過研究干旱脅迫下胡楊(Populuseuphratica)光合和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響中發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫使胡楊PSII反應(yīng)中心出現(xiàn)了可逆的失活或不可逆的破壞。在本研究中，干旱脅迫下沙蘆草的Y(II)和Fv/Fm下降，表明其PSII機構(gòu)被干旱破壞，降低了對光能的利用率和轉(zhuǎn)化率，嚴(yán)重抑制植物光合作用。另外，旱鹽復(fù)合脅迫下凈光合速率、胞間CO2濃度、Fv/Fm和Y(II)也呈現(xiàn)下降趨勢，但旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草葉片光合作用的影響小于干旱脅迫(圖1和圖2)，說明旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草幼苗的傷害?。畸}脅迫后沙蘆草幼苗凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率、Y(II)與對照相比均升高，這與張冠初等[32]在干旱和鹽脅迫下對花生(ArachishypogaeaLinn.)干物質(zhì)和光合特性的研究結(jié)果不同，說明沙蘆草能夠適應(yīng)鹽脅迫環(huán)境，其本身具有一定耐鹽性。

MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一，其含量多少是膜受損傷程度的標(biāo)志[33]。本研究結(jié)果顯示，鹽脅迫下，沙蘆草葉片中的MDA含量增加但無顯著變化(圖5)，可見沙蘆草體內(nèi)活性氧的積累和清除之間的平衡還未被破壞；在干旱和旱鹽復(fù)合脅迫下，MDA含量顯著增加(圖5)，表明這種平衡已經(jīng)遭到破壞，活性氧在沙蘆草體內(nèi)開始大量積累，而且旱鹽復(fù)合脅迫下更為嚴(yán)重，說明旱鹽復(fù)合脅迫對植物膜的傷害存在疊加效應(yīng)[34]。

POD與SOD均為植物體內(nèi)清除自由基的重要酶類，共同作用以防御自由基對細(xì)胞膜的損害[35]。在正常條件下，植物細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡之中，環(huán)境脅迫時活性氧產(chǎn)生與其清除之間的動平衡將被打破，致使活性氧過量積累[36-37]。石新建等[38]研究認(rèn)為鹽旱復(fù)合脅迫下的花花柴(Kareliniacaspica)幼苗葉片POD活性、SOD活性和CAT活性隨著脅迫時間延長逐漸升高以及張濤[39]在干旱和鹽脅迫對花楸幼苗生理生化特性的研究也表明了POD和SOD隨著脅迫時間持續(xù)而升高；在本研究中，旱、鹽、旱鹽復(fù)合脅迫后沙蘆草葉片幼苗的POD活性顯著升高(圖4)，POD活性的升高有利于活性氧的清除，降低膜脂過氧化水平，從而減輕膜傷害程度，這與王曉雪等[40]和吳淼等[41]等研究結(jié)果相符。也有研究表明，植物在水分或鹽堿脅迫下，能夠通過積累可溶性糖和脯氨酸緩解脅迫產(chǎn)生的傷害[42-43]。在本試驗中，3種脅迫下，游離脯氨酸含量升高也是沙蘆草適應(yīng)脅迫環(huán)境的一種自我保護機制。3種脅迫處理的影響程度為：干旱脅迫>旱鹽復(fù)合脅迫>鹽脅迫，表明旱鹽復(fù)合脅迫對沙蘆草的傷害小。

脅迫環(huán)境影響植物葉片相對含水量，葉片相對含水量越大，植物抵抗逆境的能力就越強[44]，因此，比較不同脅迫下植物葉片的相對含水量，可以看出植物對不同逆境脅迫的適應(yīng)性。在干旱與旱鹽復(fù)合脅迫下，沙蘆草葉片相對含水量顯著下降，在鹽脅迫下保持較高的相對含水量(圖3)，這是由于干旱和旱鹽復(fù)合脅迫導(dǎo)致土壤中水分降低，根部嚴(yán)重缺水，植物體內(nèi)的水分外滲，從而造成植物生理上的干旱。在干旱脅迫下，加入適量的鹽分使植株能夠吸收鹽離子產(chǎn)生膨壓，從而降低滲透勢[45]，提高根系從外界吸收水分的能力。在Marlinez等[46]研究發(fā)現(xiàn)，Na+能夠通過改善滲透脅迫下濱藜(Atxiplexpatens(Litv.)Iljin)光合細(xì)胞的水分狀況而促進光合作用。因此，適量土壤鹽分能夠改善植物幼苗水分狀況并且促進其幼苗生長[47]。前人研究表明植物在鹽分脅迫下，Na+濃度的增加和K+吸收的減少打破了離子間平衡[48-50]，可通過降低滲透調(diào)節(jié)和維持細(xì)胞膨大的能力或抑制代謝活性來抑制生長。沙蘆草幼苗根系和葉片中Na+/K+比含量在3種脅迫下升高，是因為根系對Na+吸收增加的同時抑制了對K+的吸收，導(dǎo)致植株地上部及根系Na+/K+含量快速上升，從而抑制沙蘆草的生長；根系中Na+/K+比含量高于葉片，可見3種脅迫環(huán)境對沙蘆草葉片影響大于根系，這與劉建新等[8]的研究結(jié)果相同。

4 結(jié)論

綜上所述，干旱脅迫抑制沙蘆草幼苗的生長，在旱鹽復(fù)合脅迫條件下，沙蘆草幼苗表現(xiàn)出一定交叉適應(yīng)性，鹽脅迫下沙蘆草幼苗生長較好，說明沙蘆草具有一定耐鹽性。