陳靜雯,韓 偉

(華東理工大學(xué) 藥學(xué)院 制藥工程與過程化學(xué)教育部工程研究中心,上海市新藥設(shè)計重點實驗室,上海 200237)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris)源于我國,是具有較高藥用價值的補益類食用菌[1-2]。由于蛹蟲草的藥理作用與冬蟲夏草類似,故被稱為北冬蟲夏草[3-4]。隨著野生冬蟲夏草資源的稀缺,越來越多的研究人員把希望寄托于蛹蟲草,側(cè)重于蛹蟲草的人工培養(yǎng)和應(yīng)用創(chuàng)新,以促進蛹蟲草的研發(fā),未來蛹蟲草產(chǎn)品將具有更加廣闊的發(fā)展前景[5-6]。

蛹蟲草多糖(CMP)是蛹蟲草中的重要活性物質(zhì),具有抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[7-10],但其含量少、提取難度較大,研究高效、低成本的蟲草多糖提取工藝成為當前的研究重點和難點[11]。傳統(tǒng)的多糖提取工藝是熱水浸提法,但該法所需時間長,提取效果不理想[12-14]。張麗麗等[15]研究了蟲草多糖的熱水浸提工藝,得到最佳提取時間為4.5 h,但最終多糖得率僅為9.69%。

近年來涌現(xiàn)了一些新型的提取技術(shù),如高溫高壓水提取、微波輔助提取、超聲輔助提取等[16-19]。本文將超聲波和酶工程技術(shù)進行結(jié)合,用于蛹蟲草多糖的提取,利用超聲波的力學(xué)和空化作用使蛹蟲草細胞壁破碎[20];同時選用適當?shù)拿笇⒓毎谶M一步分解[21],從而強化對細胞壁的破壞作用,更好地促進蛹蟲草多糖的釋放,提高提取率。通過對不同超聲波強化和酶解強化提取方式組合的篩選,確定超聲與酶解工藝,優(yōu)化工藝參數(shù),以期為蛹蟲草多糖后續(xù)產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 實驗部分

1.1 主要試劑與儀器

蛹蟲草藥材購于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所;葡糖糖標準品、果膠酶(30 000 U/mg)、中性蛋白酶(50 U/mg)購于上海麥克林生化科技有限公司;纖維素酶(50 000 U/mg)購于上海潁漢化工科技有限公司;乙醇、苯酚、硫酸均為分析純,購于上海泰坦科技股份有限公司。

UV1900 PC型紫外-可見分光光度計,上海亞研電子科技有限公司;YP520N型電子天平,上海菁華科技儀器有限公司;SHZ-DIII型循環(huán)真空水泵、RE-2010型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海予華儀器設(shè)備有限公司;SK3310HP型超聲波清洗機,上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

1.2 酶的篩選

酶法提取條件溫和,有利于提高蛹蟲草多糖的提取效果。選用不同種類的水解酶,在適宜的溫度和pH條件下進行酶解提取(表1),選取提取效果最佳的酶,為了比較酯法提取效果,采用傳統(tǒng)水提醇沉工藝得到對照組實驗結(jié)果。

表1 酶的種類與提取條件

1.3 超聲與酶解強化提取組合對比實驗

提取方案的選擇:在預(yù)實驗中發(fā)現(xiàn)單一使用酶解或超聲波處理時,蛹蟲草多糖的提取效果都不甚理想,因此選用超聲與酶解強化提取組合的形式,具體組合方式有先超聲后酶解、先酶解后超聲以及超聲耦合酶解3種。

1)先超聲后酶解強化提取:稱取3.0 g粒徑為100 μm的蛹蟲草粉末,根據(jù)60 mL/g 的液固比加入去離子水,調(diào)節(jié)pH=5.0;控制超聲功率180 W,于50 ℃超聲提取45 min;加入3.0%(質(zhì)量分數(shù))的酶,于50 ℃繼續(xù)提取45 min,在100 ℃下滅酶10 min;抽濾,將清液旋蒸后加入4倍量的95%(質(zhì)量分數(shù))乙醇,在4 ℃條件下靜置12 h;抽濾,將濾餅干燥稱量。

2)先酶解后超聲強化提取:稱取3.0 g粒徑為100 μm的蛹蟲草粉末,根據(jù)60 mL/g 的液固比加入去離子水,調(diào)節(jié)pH=5.0;加入3.0%的酶,于50 ℃提取45 min,在100 ℃下滅酶10 min;控制超聲功率180 W,50 ℃下超聲提取45 min;抽濾,將清液旋蒸后加入4倍量的95%乙醇,在4 ℃條件下靜置12 h;抽濾,將濾餅干燥稱量。

3)超聲耦合酶解強化提取:稱取3.0 g粒徑為100 μm的蛹蟲草粉末,根據(jù)60 mL/g 的液固比加入去離子水,調(diào)節(jié)pH=5.0;加入3.0%的酶,并且控制超聲功率180 W,于50 ℃下超聲提取60 min,100 ℃滅酶10 min;抽濾,將清液旋蒸后加入4倍量的95%乙醇,在4 ℃條件下靜置12 h;抽濾,將濾餅干燥稱量。

1.4 單因素實驗設(shè)計

在確定了酶的種類以及超聲與酶解強化提取組合模式后,再進行單因素實驗,分別考察酶用量(質(zhì)量分數(shù)分別為2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%)、pH(4.0、4.5、5.0、5.5、6.0)、提取時間(30、45、60、75、90 min)、提取溫度(40、45、50、55、60 ℃)、液固比(20、40、60、80、100 mL/g)等因素對蛹蟲草多糖得率的影響。

1.5 響應(yīng)面實驗設(shè)計

在單因素實驗的基礎(chǔ)上,篩選對蛹蟲草多糖提取效果影響較大的因素,采用4因素3水平Box-Behnken(BBD)實驗設(shè)計方法,以提取溫度、pH、液固比和酶用量為變量,每個變量分別設(shè)計3個水平(-1、0、+1),進行29個實驗點的三次回歸組合實驗,確定最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶的篩選結(jié)果

圖1為單一水解酶以及復(fù)合酶對蛹蟲草多糖的提取實驗結(jié)果。由圖1可得:各種水解酶輔助提取得到的多糖得率均高于傳統(tǒng)水提醇沉對照組,其中,用纖維素酶得到的多糖得率最高,為17.00%,比水提醇沉對照組(9.33%)提高了7.67%,說明纖維素酶能夠較好地作用于子實體細胞壁,使細胞壁結(jié)構(gòu)變得松散,從而提高多糖的得率,因此本文的后續(xù)研究均選用纖維素酶。

圖1 酶種類對蛹蟲草多糖得率的影響Fig.1 Effects of enzyme species on the yield of Cordyceps militaris polysaccharide

2.2 超聲與酶解強化提取組合對比實驗結(jié)果

將超聲波與纖維素酶結(jié)合應(yīng)用于蛹蟲草多糖的提取,能進一步強化對子實體細胞壁的破壞,減少傳質(zhì)阻力,更好地促進多糖的釋放和擴散,提高多糖得率。超聲與酶解強化提取3種組合方式的實驗結(jié)果如圖2所示。由圖2可得:超聲耦合酶解強化提取對蛹蟲草多糖的提取效果最好。超聲波的作用加大了纖維素酶分子的碰撞頻率,提高了動能,并且由于動能的提高,活化能減小,反應(yīng)速率加快[22]。因此,超聲耦合酶解強化提取不僅蛹蟲草多糖得率高,而且相較于另外兩種組合方式,還大大縮短了提取時間(由總提取時間90 min降至60 min),降低了成本。

圖2 超聲與酶解強化提取組合對比實驗結(jié)果Fig.2 Comparison of ultrasonic and enzymatic hydrolysis enhanced extraction results

2.3 單因素實驗結(jié)果

2.3.1 酶用量對蛹蟲草多糖得率的影響

纖維素是維持細胞壁結(jié)構(gòu)的主要成分,利用纖維素酶酶解細胞壁,可以使存在于細胞壁內(nèi)的蟲草多糖快速溶出,從而提高多糖的得率。因此,總體來說,酶用量越大,蛹蟲草多糖的得率越大(圖3)。但實驗發(fā)現(xiàn),當酶用量超過4.0%時,多糖得率反而降低,分析其原因可能是過量的纖維素酶破壞了多糖的結(jié)構(gòu),使部分多糖被降解[23]。因此,選擇纖維素酶用量為4.0%。

圖3 酶用量對蛹蟲草多糖得率的影響Fig.3 Effects of enzyme dosage on the yield of Cordyceps militaris polysaccharide

2.3.2 pH對蛹蟲草多糖得率的影響

在提取時間60 min、液固比60 mL/g、酶用量4.0%、超聲功率180 W、提取溫度50 ℃的實驗條件下,考察pH對多糖得率的影響,實驗結(jié)果見圖4。由圖4可以發(fā)現(xiàn):當提取液pH為5.0時,酶活性達到峰值,此時多糖得率最高,實驗結(jié)果與李靜等[24]得到的纖維素酶活力最適pH一致。當提取液的pH過大或者過小時,都會造成纖維素酶部分失活[25],因此,選擇提取液的pH為5.0。

圖4 pH值對蛹蟲草多糖得率的影響Fig.4 Effects of pH on the yield of Cordyceps militaris polysaccharide

2.3.3 提取時間對蛹蟲草多糖得率的影響

圖5為提取時間與蛹蟲草多糖得率之間的關(guān)系曲線。由圖5可見:隨著提取時間的延長,超聲波持續(xù)強化細胞內(nèi)有效成分的穿透能力，會促使蛹蟲草多糖向提取液擴散,因此多糖得率也隨之提高,在60～75 min時達到峰值。在75 min以后,隨著時間的延長,得率反而降低,這是因為超聲波長時間的力學(xué)剪切作用和熱效應(yīng)，導(dǎo)致多糖的結(jié)構(gòu)遭到破壞[26-27],部分多糖降解,致使得率降低。因此,后續(xù)實驗的提取時間控制在60 min。

圖5 提取時間對蛹蟲草多糖得率的影響Fig.5 Effects of extraction time on the yield of Cordyceps militaris polysaccharide

2.3.4 提取溫度對蛹蟲草多糖得率的影響

圖6為提取溫度與蛹蟲草多糖得率之間的關(guān)系曲線。由圖6可見:蛹蟲草多糖得率隨溫度的升高而升高,在55 ℃時多糖得率達到最大,較高的提取溫度不僅可以加劇分子熱運動,增加傳質(zhì)速率,而且還可以提高溶質(zhì)的溶解度[28]。但當溫度高于55 ℃后,多糖得率隨溫度升高而下降。這是由于當提取溫度超過酶的最適溫度后,酶開始變性失活,進而多糖得率開始下降[29]。因此,選擇提取溫度為55 ℃。

圖6 提取溫度對蛹蟲草多糖得率的影響Fig.6 Effects of extraction temperature on the yield of Cordyceps militaris polysaccharide

2.3.5 液固比對蛹蟲草多糖得率的影響

一般情況下,在進行液固提取時,液固比越大,得率會越高,研究液固比對蛹蟲草多糖得率的影響,結(jié)果見圖7。由圖7可見:在液固比為20～80 mL/g時,多糖得率隨液固比的增大而顯著提高,但當液固比超過80 mL/g后,多糖得率的曲線趨于平緩。水量的增加有利于水溶性多糖的溶出,但過大的加水量,會增加后續(xù)過濾、濃縮等操作的能耗負擔(dān)和工作量,同時增大了操作過程中多糖損耗的概率,從而影響多糖得率。因此,綜合考慮得率及后續(xù)操作等因素,選擇液固比為80 mL/g。

圖7 液固比對蛹蟲草多糖得率的影響Fig.7 Effects of liquid-solid ratio on the yield of Cordyceps militaris polysaccharide

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果,發(fā)現(xiàn)各因素對多糖得率均有影響,但每個因素的影響程度略有不同。為了減少BBD優(yōu)化實驗的次數(shù),提高優(yōu)化效率,對單因素實驗的結(jié)果進行方差分析,得到各因素對結(jié)果影響程度由大到小依次為酶用量、液固比、pH、提取溫度、提取時間。故選取影響顯著的因素,即酶用量、液固比、pH、提取溫度這4個因素為自變量,多糖得率為因變量進行優(yōu)化,BBD優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果見表2和3。

表2 響應(yīng)面分析因素和水平

通過Box-Behnken設(shè)計對表3中的結(jié)果進行擬合,得到蛹蟲草多糖得率與自變量酶用量、液固比、pH、提取溫度的回歸方程:Y=20.07-8.333×10-4A+0.083B+0.78C+0.25D+0.25AB+0.082AC-0.50BC+0.34BD-0.082CD+0.038A2+0.16B2+0.12C2-0.59D2。

表3 響應(yīng)面實驗設(shè)計結(jié)果

對響應(yīng)值的二次模型方差分析結(jié)果見表4,F和P用于檢驗?zāi)Ｐ惋@著性,一般情況下,P<0.05時則模型顯著,說明該模型是有效的。由表4可知:回歸項的P<0.05,說明本實驗擬合得到的二次多項模型具有較高的顯著性;且失擬項的P=0.202 0>0.05,說明模型失擬不顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義,能夠很好地分析不同提取條件對蟲草多糖得率的影響。

表4 回歸方程模型系數(shù)評估及其顯著性檢驗

對回歸模型進一步分析,確定超聲耦合酶解強化提取的最佳工藝條件:提取溫度為50.14 ℃,pH為4.52,超聲功率為180 W,液固比為99.97 mL/g,酶用量為3.98%,此時蛹蟲草多糖得率為21.70%?？紤]到實際操作的可行性,將工藝條件稍做調(diào)整:提取溫度為50 ℃,pH為4.5,超聲功率為180 W,液固比為100 mL/g,酶用量為4.0%,提取時間為60 min,在此條件下重復(fù)進行3次驗證實驗,得到的多糖得率平均值為22.00%,略高于預(yù)測值,相對標準偏差RSD=0.33%,比文獻傳統(tǒng)熱水浸提法得到的多糖得率(9.31%)提高1倍以上,表明上述模型預(yù)測準確,所選工藝有良好的重現(xiàn)性。

3 結(jié)論

1)超聲耦合酶解強化提取得到的蛹蟲草多糖得率最高,明顯優(yōu)于先超聲后酶解及先酶解后超聲兩種提取方法。超聲耦合酶解強化提取所需時間短,條件溫和,是一種高效綠色的提取方法。

2)通過單因素實驗和響應(yīng)面分析法優(yōu)化工藝參數(shù),得到蛹蟲草多糖的最佳提取工藝:提取溫度為50 ℃,pH為4.5,超聲功率為180 W,液固比為100 mL/g,酶用量為4.0%,提取時間為60 min,在此條件下多糖得率為22.00%±0.33%,比傳統(tǒng)熱水浸提法得到的多糖得率(9.31%)提高1倍以上。