李嵐嵐，戴利銘，蔣桂芝，劉一賢，施玉萍，蔡志英

摘? 要：目前化學(xué)農(nóng)藥的缺點(diǎn)日益突顯，研發(fā)環(huán)保的生防菌劑是當(dāng)前綠色安全的一種方法，篩選具有抑制橡膠樹(shù)炭疽病的生防菌株，為研發(fā)新型生防菌劑儲(chǔ)備資源。本文采用組織培養(yǎng)法分離純化橡膠樹(shù)內(nèi)生菌，平板對(duì)峙篩選拮抗菌株;通過(guò)菌株培養(yǎng)特征、生理生化、根據(jù)16S rRNA和gyrA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)確定其分類(lèi)地位;采用平板對(duì)峙法研究?jī)?nèi)生菌株的抗菌持久性、穩(wěn)定性、廣譜性;采用牛津杯法研究拮抗內(nèi)生菌對(duì)殺菌劑的敏感性。從橡膠樹(shù)健康的根組織中分離得到4株對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病具有抑制作用的細(xì)菌（Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4），系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果顯示這4株細(xì)菌與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）親緣關(guān)系很近，且培養(yǎng)性狀和生理生化特征也與解淀粉芽孢桿菌相似。這4株內(nèi)生菌的抗菌持久性強(qiáng)，抗菌穩(wěn)定性好;對(duì)尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）DFMP1E和MLZZP3、小孢擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsis microspora）MF375898均有較強(qiáng)的抑菌能力，對(duì)茄類(lèi)鐮刀菌（Fusarium solani）XJ160901的抑制作用較弱;對(duì)多菌靈、異菌脲、百菌清、苯醚甲環(huán)唑4種殺菌劑均不敏感，有望開(kāi)發(fā)為生防菌劑。

關(guān)鍵詞：橡膠樹(shù)炭疽病;解淀粉芽孢桿菌;生防內(nèi)生菌;分離鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S763.7;S794.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Isolation， Identification and Bacteriostasis Study of Endophytic Bacteria to Control Colletotrichum Leaf Disease on Rubber Tree

LI Lanlan， DAI Liming， JIANG Guizhi， LIU Yixian， SHI Yuping， CAI Zhiying*

Yunnan Institute of Tropical Crops， Jinghong， Yunnan 666100， China

Abstract： At present， the disadvantages of chemical pesticides are prominent and the development of environmental friendly biocontrol agent is needed. The screening of biocontrol strains with inhibition of rubber anthracnose can reserve resources for the development of new biocontrol agents. The endophyte bacteria of rubber trees were isolated and purified by tissue culture， and growth plate-confrontation was used to screen antagonistic strains. Strain Bac RZS3D4-1， Bac RZS3D4-2， Bac RZS3D4-3， Bac RZS3D4-4 were identified based on morphological， physiological， biochemical characteristics and the phylogenetic tree was constructed with 16S rRNA and gyrA gene sequence. The growth plate-confrontation was used to study the antimicrobial persistence， stability and broad spectrum of endophytic bacteria. The Oxford cup method was used to study the sensitivity of antagonistic endophytic bacteria to fungicides. Four strains of bacteria （Bac RZS3D4-1， Bac RZS3D4-2， Bac RZS3D4-3， Bac RZS3D4-4） were isolated from the healthy root tissues of rubber trees. Phylogenetic tree analysis showed that the four strains were closely related to Bacillus amyloliquefaciens， and the culture traits and physiological and biochemical characteristics were similar to those of B. amyloliquefaciens. The results showed the strains had strong antibacterial persistence and good antibacterial stability， strong antibacterial activity against Colletotrichum acutatum （DFMP1E and Mlzzp3） and Pestalotiopsis microspora （MF375898）， and weak inhibitory effect on Fusarium solani （XJ160901）. They were not sensitive to carbendazim， isocarb， chlorothalonil and difenoconazole， so it is expected to be developed as a biocontrol agent.

Keywords： Colletotrichum leaf disease on rubber tree; Bacillus amyloliquefaciens; biocontrol endophytic microorganism; isolated identification

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.028

炭疽病是橡膠樹(shù)上的重要病害，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)會(huì)導(dǎo)致橡膠樹(shù)葉片落光，膠乳產(chǎn)量下降[1]。橡膠樹(shù)炭疽病在世界各國(guó)植膠區(qū)均有發(fā)生，廣泛分布于南美洲、非洲中部、亞洲南部和東南部等地[2]。主要是由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）引起的，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外廣泛流行，發(fā)病趨勢(shì)日益嚴(yán)重，導(dǎo)致橡膠產(chǎn)業(yè)損失逐年增加[3-5]。橡膠樹(shù)炭疽病危害膠苗、大田幼樹(shù)和開(kāi)割膠樹(shù)，侵染嫩葉、葉柄、嫩梢和果實(shí)等多個(gè)部位，引起嫩葉脫落、嫩梢回枯和果實(shí)腐爛等，嚴(yán)重時(shí)引起膠樹(shù)重復(fù)落葉和嫩梢回枯，導(dǎo)致開(kāi)割時(shí)間推遲[2-4]。橡膠樹(shù)炭疽病在西雙版納地區(qū)膠苗苗圃中每年均有發(fā)生，1963—1964年，景洪農(nóng)場(chǎng)的實(shí)生苗和芽接苗上就發(fā)生了此病，造成嚴(yán)重落葉、嫩梢回枯，之后每年該病在橡膠苗圃均有不同程度的發(fā)生[3-8]。

目前，橡膠樹(shù)炭疽病的防治主要以化學(xué)藥劑結(jié)合農(nóng)業(yè)防治措施為主。農(nóng)業(yè)防治措施包括改善苗圃陰濕環(huán)境、合理施肥，提高膠苗抗病能力;開(kāi)割膠林，清理枯枝落葉及林間雜草，修剪枝葉，改善膠林通風(fēng)和光照條件等。通過(guò)改善膠樹(shù)生長(zhǎng)環(huán)境，提高膠樹(shù)的抗病能力[1， 9-10]。農(nóng)業(yè)防治措施難以大面積推廣，且只能在短期內(nèi)局部控制病情的蔓延。選用以多菌靈為代表的苯并咪唑類(lèi)農(nóng)藥和以咪鮮胺為代表的麥角甾醇類(lèi)生物合成制劑及其復(fù)配劑作為化學(xué)防治的主要藥劑[5， 10-13]。然而如果不科學(xué)使用化學(xué)農(nóng)藥，或是長(zhǎng)期大量使用單一化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行病害防治，容易造成防效下降及抗藥性等問(wèn)題，并且大量使用化學(xué)農(nóng)藥也會(huì)對(duì)土壤和水資源造成嚴(yán)重污染，對(duì)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境造成破壞[14-15]。目前，已報(bào)道的防治炭疽病的生防菌種類(lèi)較多，以芽孢桿菌和放線(xiàn)菌研究最為廣泛，芽孢桿菌中又以枯草芽孢桿菌為主，已經(jīng)在病害防治上得到廣泛應(yīng)用，多應(yīng)用于蔬菜瓜果及糧食作物病害的防治[16-19]。梁艷瓊等[20]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Czk1產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)橡膠樹(shù)根病病菌和橡膠樹(shù)炭疽病菌具有一定的抑制效果，樊蘭艷[19]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌Czk1產(chǎn)生的脂肽類(lèi)粗提物對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病有抑制作用;劉一賢等[21]發(fā)現(xiàn)桑樹(shù)鏈霉菌對(duì)橡膠樹(shù)褐根病、白根病等具有抑制作用。

隨著人們環(huán)保意識(shí)的逐漸增強(qiáng)和生產(chǎn)需求的不斷發(fā)展，化學(xué)農(nóng)藥的缺點(diǎn)日益突顯，尋求高效、環(huán)保且行之有效的防治方法勢(shì)在必行[14-15]。因此對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病生防菌的開(kāi)發(fā)利用顯得尤為重要，植物內(nèi)生菌是生防菌的重要來(lái)源，所以研究橡膠樹(shù)內(nèi)生菌具有重要意義。本研究從橡膠樹(shù)組織中篩選具有生防作用的內(nèi)生菌，并對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生理生化和分子生物學(xué)鑒定;同時(shí)研究拮抗菌對(duì)尖孢炭疽菌的抗菌持久性、穩(wěn)定性、抑菌譜和對(duì)殺菌劑的敏感性，為研發(fā)新型生防菌劑儲(chǔ)備資源。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試樣品? 從云南省紅河（河口、金平）、景洪等植膠區(qū)采集橡膠樹(shù)莖干、根等組織（選取成年老橡膠樹(shù)），使用打孔器在樹(shù)干和根上鉆孔獲取組織樣品，裝入自封袋，填寫(xiě)標(biāo)簽，封好袋子，帶回實(shí)驗(yàn)室分離。

1.1.2? 培養(yǎng)基? Luria-Bertani培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar）、高氏一號(hào)培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（nutrient agar）、NYD培養(yǎng)基、BPY培養(yǎng)基、PGY培養(yǎng)基、TGE培養(yǎng)基[22-24]。

1.1.3? 主要試劑? 細(xì)菌基因組提取試劑盒（Bacteria Genomic Kit）：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司;PCR引物：北京六合華大基因科技有限公司合成;葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨、瓊脂等分析純?cè)噭荷ど锕こ蹋ㄉ虾＃┕煞萦邢薰?50%多菌靈可濕性粉劑：江蘇藍(lán)豐生物化工股份有限公司，75%百菌清可濕性粉劑：先正達(dá)（蘇州）作物保護(hù)有限公司，50%異菌脲可濕性粉劑：蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司，10%苯醚甲環(huán)唑水分散粒劑：先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司。

1.1.4? 供試菌株? 尖孢炭疽病菌株（C. acutatum）：菌株編號(hào)DFMP1E和MLZZP3，膠孢炭疽病菌（C. gloeosporioides）：菌株編號(hào)NPS1a-2，棒孢霉落葉病菌（Corynespora cassiicola）：菌株編號(hào)JCMP7A，橡膠樹(shù)褐根病菌（Phellinus noxius）：菌株編號(hào)JPNC4，小孢擬盤(pán)多毛孢（Pestalotiopsis microspora）：菌株編號(hào)MF375898，橡膠疫霉（Phytophthora heveae）：菌株編號(hào)OJ20180523，五隔大無(wú)性孢麗赤殼菌（Calonectria pentaseptata）：菌株編號(hào)OJ20180629，茄類(lèi)鐮刀菌（Fusarium solani）：菌株編號(hào)XJ160901，以上靶標(biāo)病原菌均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.2? 方法

1.2.1? 內(nèi)生菌的分離與純化? 將從植膠區(qū)采集的健康橡膠樹(shù)組織洗凈，用0.1%升汞溶液和75%酒精表面消毒，用滅菌水反復(fù)沖洗，吸干表面水份，去掉植物組織最外層，切成小塊，分別放入LB、PDA和高氏1號(hào)平板培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以最后一次清洗植物組織的滅菌水作為對(duì)照[25-28]。將平板放入28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，1～2 d后取出LB平板，挑取單菌落劃線(xiàn)接種到新的LB平板，并編號(hào);4～5 d后取出PDA和高氏1號(hào)平板，挑取單菌落分別接種到相應(yīng)的培養(yǎng)基上，并編號(hào)。純化后分別于斜面4 ℃保存、甘油管–80 ℃保存[29]。

1.2.2? 拮抗內(nèi)生菌初篩和復(fù)篩? 以尖孢炭疽菌株MLZZP3和膠孢炭疽菌株NPS1a-2作為指示菌，采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法進(jìn)行初篩，觀察有無(wú)抑菌帶，篩選出具有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌[30-31]。

對(duì)初篩得到的有拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行復(fù)篩，采用平板對(duì)峙法，以只接病原菌作為對(duì)照，培養(yǎng)7 d后，計(jì)算指示菌抑菌率。抑制率=（對(duì)照組菌落生長(zhǎng)直徑–處理組菌落生長(zhǎng)直徑）/（對(duì)照組菌落生長(zhǎng)直徑–接種菌塊直徑）×100%[15， 30-32]

1.2.3? 拮抗內(nèi)生菌的鑒定? 菌落形態(tài)特征：將拮抗內(nèi)生菌Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4分別接種在LB、NA、PDA、NYD、BPY、PGY、TGE等培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)1 d，觀察4株內(nèi)生菌的菌落形態(tài)。參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[33]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[34]的方法，對(duì)拮抗菌進(jìn)行革蘭氏染色，并在光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果和菌株形態(tài)。

生理生化指標(biāo)：參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[33]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[34]的方法，對(duì)拮抗菌的M.R試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、淀粉水解、硝酸鹽還原、脂酶試驗(yàn)、明膠水解、反硝化、檸檬酸鹽利用等生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征：提取菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的基因組總DNA，采用16S rRNA基因的通用引物對(duì)提取的基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)采用引物gyrA-F（5-CAGTCAGGAAA TGCGTACGTCCTT-3）和gyrA-R（5-CAAGGTA ATGCTCCAGGCATTGCT-3）對(duì)gyrA基因進(jìn)行擴(kuò)增[35-37]。

1.2.4? 拮抗內(nèi)生菌的抗菌持久性研究? 以尖孢炭疽菌株DFMP1E為指示菌，采用平板對(duì)峙法，以只接種指示菌作為對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)5、10、15、20、25、30 d后，測(cè)量指示菌菌落直徑，計(jì)算指示菌的抑菌率[38-39]。

1.2.5? 拮抗內(nèi)生菌的抗菌穩(wěn)定性研究? 以尖孢炭疽菌株DFMP1E為指示菌，采用平板對(duì)峙法，將拮抗菌在培養(yǎng)基上連續(xù)轉(zhuǎn)接多代，以不同代的拮抗菌作為處理，以只接種指示菌的處理作為對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，計(jì)算指示菌的抑菌率[40-41]。

1.2.6? 拮抗內(nèi)生菌抗菌譜研究? 以菌株編號(hào)為DFMP1E、MLZZP3、NPS1a-2、JCMP7A、JPNC4、MF375898、OJ20180523、OJ20180629、XJ160901的9個(gè)病原菌作為指示菌，采用平板對(duì)峙法，計(jì)算指示菌的抑菌率，評(píng)價(jià)拮抗菌的抗菌廣譜性[38， 42-43]。

1.2.7? 拮抗內(nèi)生菌對(duì)殺菌劑的敏感性? 牛津杯法測(cè)4株拮抗內(nèi)生細(xì)菌對(duì)多菌靈（1388.9 mg/kg）、異菌脲（694.4 mg/kg）、百菌清（2777.8 mg/kg）、苯醚甲環(huán)唑（200 mg/kg）的敏感性，每個(gè)處理重復(fù)3次，以加無(wú)菌水的處理作為對(duì)照，28 ℃恒溫培養(yǎng)1～2 d后，觀察是否產(chǎn)生抑菌圈[44-45]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 內(nèi)生菌的分離與純化

從云南省植膠區(qū)紅河（河口、金平）、景洪等地采集橡膠樹(shù)根、莖干組織樣品共25份，分離得到156株菌，其中64株真菌，92株細(xì)菌。

2.2? 拮抗內(nèi)生菌的初篩和復(fù)篩

通過(guò)平板對(duì)峙法對(duì)分離得到的156株內(nèi)生菌進(jìn)行初篩和復(fù)篩，篩選得到4株對(duì)炭疽病菌有較好抑制作用的細(xì)菌菌株（圖1），分別編號(hào)為：Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4。結(jié)果顯示4株菌對(duì)供試病原真菌都具有抑制作用，對(duì)尖孢炭疽病菌MLZZP3（C. acutatum）的抑菌率分別為74.80%、62.59%、75.47%、74.35%，對(duì)膠孢炭疽病菌NPS1a-2（C. gloeosporioides）的抑菌率分別為59.52%、47.48%、61.87%、60.78%。

2.3? 拮抗內(nèi)生菌的鑒定

2.3.1? 菌落形態(tài)特征? 拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4在LB、NA、PDA、NYD、BPY、PGY、TGE 7種供試培養(yǎng)基中均能良好生長(zhǎng)，但在不同的培養(yǎng)基上菌落形態(tài)有差異（表1）。4株菌革蘭氏染色均為陽(yáng)性，菌體呈桿狀，兩端鈍圓。

2.3.2? 生理生化特征? 菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的生理生化特征如表2所示，4株菌的甲基紅試驗(yàn)均為陰性，V-P試驗(yàn)均為陽(yáng)性，均能產(chǎn)生過(guò)氧化氫酶、淀粉水解酶，均能使硝酸鹽還原、明膠水解，均不產(chǎn)生脂酶，均能夠利用檸檬酸鹽，反硝化反應(yīng)均為陽(yáng)性。

2.3.3? 系統(tǒng)發(fā)育學(xué)特征? 用16S rRNA基因通用引物對(duì)4株拮抗菌株進(jìn)行序列擴(kuò)增并測(cè)序，得到1400 bp左右的序列，將序列提交到GenBank，獲得登錄號(hào)分別為MT747964、MT747965、MT747966、MT747967，經(jīng)BLAST比對(duì)，選取覆蓋度和相似性較高且有效發(fā)表的菌株進(jìn)行16SrRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析，通過(guò)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)發(fā)現(xiàn)，從聚類(lèi)結(jié)果可以看出4株拮抗菌株與芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）聚在同一個(gè)分支上。16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果顯示4株菌株均屬于芽孢桿菌。

gyrA基因序列提交到GenBank，獲得登錄號(hào)分別為MW041644、MW041643、MW041642、MW041641。菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的gyrA基因序列與解淀粉芽孢桿菌L-1、X-L、TN0501、10A18的gyrA基因序列同源性較高，與解淀粉芽孢桿菌L-1、X-L、TN0501、10A18屬同一分支（圖2）。

綜合拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4- 2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的菌落形態(tài)特征、革蘭氏染色、生理生化指標(biāo)與16S rRNA基因序列和gyrA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，將拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4鑒定為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）。

2.4? 拮抗內(nèi)生菌的抗菌持久性研究

培養(yǎng)30 d，對(duì)照組病原菌菌落直徑從5 mm增長(zhǎng)到86.10 mm，接種拮抗菌株Bac RZS3D4-1的處理病原菌菌落直徑從5 mm增長(zhǎng)到27.06 mm，接種Bac RZS3D4-2的處理病原菌菌落直徑從5 mm增長(zhǎng)到35.34 mm，接種Bac RZS3D4-3的處理病原菌菌落直徑從5 mm增長(zhǎng)到24.91 mm，接種Bac RZS3D4-4的處理病原菌菌落直徑從5 mm增長(zhǎng)到27.43 mm。以上數(shù)據(jù)表明，培養(yǎng)30 d后接種拮抗菌株的處理病原菌菌落的增長(zhǎng)速度明顯小于對(duì)照組，表明4株拮抗菌株均能持久抑制病原菌的生長(zhǎng)。

拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)病原菌的抑制率見(jiàn)表3，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，抑菌率呈先升后降的趨勢(shì)，而且前期增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯，后期下降趨勢(shì)不明顯，后期抑制率無(wú)顯著性差異，表明拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4對(duì)病原菌的抑制作用較持久。

2.5? 拮抗內(nèi)生菌的抗菌穩(wěn)定性研究

拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的不同世代對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E均有較高的抑制作用。4株拮抗菌株從第1代到第10代對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E的抑制率有一定波動(dòng)，分別為：菌株Bac RZS3D4-1的抑制率為（69.24%±0.03%）～（72.95%± 0.09%），菌株Bac RZS3D4-2抑制率為（56.69%± 0.58%）～（60.63%±0.21%），Bac RZS3D4-3的抑制率為（68.81%±0.23%）～（71.64%±0.33%），Bac RZS3D4-4的抑制率為（68.94%±0.60%）～（70.43%± 0.02%）。雖然抑制率有所波動(dòng)，但波動(dòng)范圍較小，表明拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E的拮抗作用比較穩(wěn)定。

2.6? 拮抗內(nèi)生菌抗菌譜研究

拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4對(duì)9種供試病原真菌均有抑制作用（表4），表明4株拮抗菌株的抗菌譜較廣，且菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的抑菌能力較菌株Bac RZS3D4-2強(qiáng)。4株拮抗菌株對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E、MLZZP3和小孢擬盤(pán)多毛孢M(jìn)F375898三種病原菌的抑菌能力較強(qiáng)，對(duì)茄類(lèi)鐮刀菌XJ160901的抑制作用最弱。

2.7? 拮抗內(nèi)生菌對(duì)殺菌劑的敏感性

通過(guò)拮抗菌對(duì)殺菌劑的敏感性試驗(yàn)，處理組和對(duì)照組的拮抗菌都正常生長(zhǎng)，沒(méi)有產(chǎn)生抑菌圈，表明拮抗菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4對(duì)供試的多菌靈、異菌脲、百菌清、苯醚甲環(huán)唑在生產(chǎn)上使用的最高濃度不敏感。

3? 討論

本研究采用菌落形態(tài)學(xué)、生理生化指標(biāo)和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方法對(duì)分離得到的內(nèi)生菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4- 3、Bac RZS3D4-4進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明4株菌株的菌落形態(tài)和生理生化指標(biāo)與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）基本一致，且對(duì)4株菌的16S?rRNA基因序列和gyrA基因序列擴(kuò)增測(cè)序并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，16S rRNA基因序列比對(duì)結(jié)果僅顯示4株菌株屬于芽孢桿菌，無(wú)法確定其分類(lèi)地位;通過(guò)gyrA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)4株菌株與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）的相似度極高，綜上所述初步鑒定菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4為解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）[35-37， 46-49]。

4株拮抗菌株對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E（C. acutatum）的抑制作用呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，而且前期增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯，后期下降趨勢(shì)不明顯。前期處理組因拮抗菌的抑制作用，指示菌的生長(zhǎng)速度較對(duì)照組慢，所以抑制率逐漸增加，且增幅明顯。后期由于培養(yǎng)皿、培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)等因素的限制，抑菌率有微弱下降，但是下降趨勢(shì)不明顯，4株拮抗菌株對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E的抑菌持久性較好。

4株拮抗菌株的不同世代對(duì)尖孢炭疽病菌DFMP1E均有較高的抑制作用，且抗菌穩(wěn)定性較好。4株拮抗菌株對(duì)9種供試病原真菌均有不同程度的抑制作用，抗菌譜較廣，菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4的抑制能力較菌株Bac RZS3D4-2強(qiáng)。4株拮抗菌株對(duì)常用的4種殺菌劑（多菌靈、異菌脲、百菌清、苯醚甲環(huán)唑）不敏感。

菌株Bac RZS3D4-1、Bac RZS3D4-2、Bac RZS3D4-3、Bac RZS3D4-4相較于土壤分離等其他來(lái)源的菌株具有一定優(yōu)勢(shì)：（1）來(lái)源于植物組織內(nèi)，與宿主長(zhǎng)期進(jìn)化，已經(jīng)適應(yīng)了宿主的內(nèi)環(huán)境，能夠迅速在植物體內(nèi)定殖，并且穩(wěn)定生存;（2）屬于解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens），已有研究表明，解淀粉芽孢桿菌具備快速在植物體內(nèi)穩(wěn)定高效地定殖，占據(jù)病原菌的生態(tài)位點(diǎn)，達(dá)到抑制植物病原菌的侵入和定殖的能力[50-58]，能夠長(zhǎng)期穩(wěn)定的達(dá)到抑制病害發(fā)生發(fā)展的作用;（3）4株菌株對(duì)殺菌劑不敏感，在開(kāi)展生防菌劑的研發(fā)時(shí)，可以考慮與某些殺菌劑混配。前期殺菌劑快速殺滅植物病原菌以控制病害的發(fā)生發(fā)展，但化學(xué)藥劑有效期較短，后期拮抗菌能夠在植物體內(nèi)定殖，長(zhǎng)期穩(wěn)定地抑制病害的發(fā)生發(fā)展;并且拮抗菌定殖后，使用該菌不敏感的殺菌劑對(duì)定殖的拮抗菌也沒(méi)有影響。

目前，雖然生防菌劑在生產(chǎn)上已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，多用于蔬菜、瓜果、糧食作物類(lèi)，而對(duì)于高大林木如橡膠樹(shù)等的生防菌劑的研發(fā)多停留在實(shí)驗(yàn)室階段，因環(huán)境、宿主、防效緩慢，防治時(shí)效短等因素使生防菌劑的田間應(yīng)用受到局限[16-19]。本研究主要是以離體實(shí)驗(yàn)為主，為以后的大田試驗(yàn)提供數(shù)據(jù)參考，后期將逐步把研究重點(diǎn)放在發(fā)酵菌液大田試驗(yàn)應(yīng)用和生防菌株在植物體內(nèi)的定殖等方面。

參考文獻(xiàn)

[1] 趙璐璐. 枯草芽孢桿菌Czk1發(fā)酵工藝的優(yōu)化及其對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病、根病生防效果初步研究[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2011.

[2] 古? 鑫. 22種植物提取物防治橡膠樹(shù)炭疽病的研究[D]. ?？冢?海南大學(xué)， 2012.

[3] 蔡志英， 黃貴修. 巴西橡膠樹(shù)炭疽病研究進(jìn)展[J]. 西南林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2011， 31（1）： 89-93.

[4] 李加智， 張春霞， 何明霞. 云南橡膠樹(shù)葉炭疽病病狀及發(fā)生近況[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技， 2008（3）： 13-16.

[5] 蔡志英， 李加智， 何明霞， 等. 三種熱霧劑對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病大田防治試驗(yàn)[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科技， 2009， 32（3）： 10-11.

[6] 張春霞， 何明霞， 李加智， 等. 云南西雙版納地區(qū)橡膠炭疽病病原鑒定[J]. 植物保護(hù)， 2008（1）： 103-106.

[7] 陳荃英. 橡膠炭疽菌生物學(xué)特性觀察[J]. 云南熱作科技， 1982（3）： 25-27， 29.

[8] 史學(xué)群. 橡膠樹(shù)對(duì)炭疽病抗病機(jī)制的研究[D]. 儋州： 華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2001.

[9] 鄭? 鵬， 何? 靜， 常凱軍， 等. 橡膠樹(shù)枝條內(nèi)生真菌的分離及其拮抗性的測(cè)定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2009， 30（6）： 832-837.

[10] 李? 兵， 韓開(kāi)倫， 張? 云， 等. 景洪農(nóng)場(chǎng)橡膠樹(shù)炭疽病的發(fā)生及防治措施[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊， 2012（3）： 200-201.

[11] 曹學(xué)仁， 車(chē)海彥， 楊? 毅， 等. 2014年海南省橡膠炭疽病菌對(duì)多菌靈和咪鮮胺的敏感性測(cè)定[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2015， 45（6）： 626-631

[12] 殷永濤. 一種混合物對(duì)橡膠樹(shù)白粉病、炭疽病防控作用研究[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2012.

[13] 鄭行愷. 海南省橡膠樹(shù)炭疽病監(jiān)測(cè)及其防治藥劑施用技術(shù)研究[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2019.

[14] 張? 凱， 吳曼莉， 辜柳霜， 等. 膠孢炭疽菌生防放線(xiàn)菌gz-8的鑒定及生物活性初步評(píng)價(jià)[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào)， 2017， 19（6）： 708-715.

[15] 辜柳霜， 張?jiān)馒P， 張? 凱， 等. 膠孢炭疽菌生防放線(xiàn)菌SD-29的鑒定及抗菌活性評(píng)價(jià)[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2019， 46（4）： 770-779.

[16] 程歡歡， 余? 水， 姚偉偉， 等. 辣椒炭疽病生防芽孢桿菌的篩選及田間防效[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2019， 53（4）： 568-573.

[17] 趙璐璐， 賀春萍， 鄭肖蘭， 等. 枯草芽孢桿菌Czk1菌株對(duì)橡膠樹(shù)根病菌的抑制作用及對(duì)炭疽病生防效果研究初報(bào)[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2011， 42（7）： 740-743.

[18] 謝? 立， 賀春萍， 梁艷瓊， 等. 枯草芽孢桿菌Czk1與化學(xué)殺菌劑協(xié)同防治橡膠樹(shù)根病[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2020， 41（8）： 1625-1633.

[19] 樊蘭艷. 橡膠樹(shù)內(nèi)生枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Czk1抗菌活性物質(zhì)的初步研究[D]. 海口： 海南大學(xué)， 2013.

[20] 梁艷瓊， 唐? 文， 董文敏， 等. 枯草芽孢桿菌菌株Czk1揮發(fā)性物質(zhì)的抑菌活性及其組分分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2019， 50（11）： 2465-2474.

[21] 劉一賢， 施玉萍， 戴利銘， 等. 橡膠褐根病拮抗放線(xiàn)菌17-7的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2020， 47（1）： 118-129.

[22] 安俊瑩. 海洋源解淀粉芽孢桿菌細(xì)菌素CAMT2發(fā)酵優(yōu)化、分離及抗菌機(jī)理研究[D]. 湛江： 廣東海洋大學(xué)， 2014.

[23] 牛世全， 耿? 暉， 閻薇如， 等. 黃芪根腐病生防放線(xiàn)菌篩選鑒定及其優(yōu)化培養(yǎng)[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2016， 43（6）： 943-950.

[24] 郭曉平， 劉興飛， 李曉楠， 等. 泰山黃精內(nèi)生細(xì)菌的抗菌活性研究[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2020， 36（11）： 48-54.

[25] 陳建英， 陳肖學(xué)， 羅旭璐， 等. 香竹箐栽培型古茶樹(shù)內(nèi)生真菌對(duì)植物病原真菌的拮抗活性[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)）， 2020， 35（3）： 422-429.

[26] 鄭? 旭. 馬鈴薯內(nèi)生菌的分離鑒定及抑龍葵堿功能研究[D]. 北京： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2019.

[27] 褚衍亮， 劉宇佳， 姚? 婷， 等. 一株產(chǎn)蛋白酶植物內(nèi)生菌的分離、鑒定及產(chǎn)酶條件研究[J]. 江蘇科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2019， 33（1）： 93-99， 120.

[28] 湯冰雪. 竹葉蘭內(nèi)生菌的分離鑒定及生物活性研究[D]. 廣州： 華南理工大學(xué)， 2018.

[29] 孫愛(ài)琴. 基層微生物實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)菌株的制備和保藏方法[J]. 醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制， 2015， 31（8）： 942， 945.

[30] 常? 棟， 顧建國(guó)， 賈方方， 等. 煙草黑脛病不同植物源生防菌的篩選及防效測(cè)定[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)， 26（3）： 84-90.

[31] 謝林艷， 狄義寧， 何麗蓮， 等. 甘蔗赤腐病內(nèi)生拮抗菌YC89的篩選及鑒定[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2020， 60（4）： 739-748.

[32] 于地美， 黃華毅， 梁小文， 等. 一株生防真菌TRCC27001的鑒定及其抑菌特性[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2019， 48（2）： 148-154.

[33] 東秀珠， 蔡妙英. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2001： 349-387.

[34] Krieg N R， Staley J T， Brown D R， et al. Bergeys Manual of Systematic Bacteriology[M]. Baltimore： Williams &Wilkins， 1986.

[35] 荊卓瓊， 郭致杰， 徐生軍， 等. 解淀粉芽孢桿菌HZ-6-3的篩選鑒定及其防治番茄灰霉病效果的評(píng)價(jià)[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2020， 29（2）： 31-41.

[36] 盧鈺升， 顧文杰， 蔣瑞萍， 等. 一株生防細(xì)菌GB58的鑒定與抑菌能力測(cè)定[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2016， 32（6）： 198-204.

[37] 戴利銘， 李嵐嵐， 劉一賢， 等. 解淀粉芽孢桿菌生防菌BS-3全基因組測(cè)序及生物信息分析[J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 2021， 48（6）： 2073-2088.

[38] 付紅梅. 大豆疫霉拮抗菌株的篩選、鑒定及拮抗物質(zhì)的初步分析[D]. 合肥： 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011.

[39] 趙旖森， 張? 亮， 盛? 浩， 等. 辣椒疫霉病生防細(xì)菌的篩選鑒定及其防效[J]. 中國(guó)蔬菜， 2019（1）： 65-69.

[40] 黃明媛. 番茄青枯病拮抗菌篩選鑒定及發(fā)酵條件研究[D]. 哈爾濱： 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2011.

[41] 代? 鵬， 張? 霞， 楊臘英， 等. 抗生素產(chǎn)生菌Streptomyces albogriseus發(fā)酵液的抗菌譜及穩(wěn)定性測(cè)定[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2009， 30（1）： 86-89.

[42] 胡曉丹. 禾谷鐮刀菌拮抗菌的篩選鑒定及拮抗特性研究[D]. 南京： 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014.

[43] 汪漢成， 王茂勝， 黃艷飛， 等. 煙草青枯病拮抗菌株X-60的分離鑒定及其表型組學(xué)分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào)， 2016， 46（3）： 409-419.

[44] 閆建芳， 劉? 秋， 趙柏霞， 等. 番茄潰瘍病生防菌YH23的發(fā)酵條件優(yōu)化及菌種鑒定[J]. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2019， 50（5）： 608-613.

[45] 孫? 露， 單瀟瀟， 蔣建蘭， 等. 一株對(duì)稻瘟病菌有抗菌活性的特基拉芽孢桿菌 WRN032的篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)， 2020， 32（5）： 860-866， 881.

[46] 穆曉雅， 譚志瓊， 劉? 銅， 等. 一種新的黃瓜細(xì)菌性葉斑病拮抗細(xì)菌的篩選鑒定及其發(fā)酵條件的初步研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2019， 32（4）： 837-842.

[47] 符可芯， 楊? 葉， 曾耿狄. 熱帶土壤中解淀粉芽孢桿菌HNU1的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)， 2020， 22（6）： 49-59.

[48] 司世飛， 宋莉莎， 任? 靜， 等. 一株抗煙草赤星病解淀粉芽孢桿菌的篩選及鑒定[J]. 河北大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2018， 38（4）： 410-415.

[49] 李曉宇. 解淀粉芽孢桿菌LXY-6-2篩選、鑒定、誘變與發(fā)酵條件優(yōu)化及其對(duì)辣椒根腐病的生物防治研究[D]. 楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2018.

[50] Tan S Y， Jiang Y， Song S， et al. Two Bacillus amyloliquefaciens strains isolated using the competitive tomato root enrichment method and their effects on suppressing Ralstonia solanacearum and promoting tomato plant growth[J]. Crop Protection， 2013， 43： 134-140.

[51] Weng J， Wang Y， Li J， et al. Enhanced root colonization and biocontrol activity of Bacillus amyloliquefaciens SQR9 by abrB gene disruption[J]. Applied Microbiology & Biotechnology， 2013， 97（19）： 8823-8830.

[52] 譙天敏， 張? 靜， 冉曉瀟， 等. 解淀粉芽孢桿菌在山茶葉中的定殖及對(duì)山茶灰斑病的防效[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2015， 43（10）： 77-84.

[53] 楊洪鳳， 薛雅蓉， 余向陽(yáng)， 等. 內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌CC09菌株在小麥葉部的定殖能力及其防治白粉病效果研究[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)， 2014， 30（4）： 481-488.

[54] 張? 楠， 吳? 凱， 沈怡斐， 等. 根際益生菌解淀粉芽孢桿菌SQR9在香蕉根表的定殖行為研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2014， 37（6）： 59-65.

[55] 胡? 偉， 趙蘭鳳， 張? 亮， 等. 香蕉枯萎病生防菌AF11的鑒定及其定殖研究[J]. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào)， 2012， 28（3）： 387-393.

[56] 王? 雪， 張丹妮， 王春偉， 等. 解淀粉芽孢桿菌FS6在人參體內(nèi)的定殖特性及對(duì)人參誘導(dǎo)抗病性[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2019， 47（7）： 125-130， 138.

[57] 崔? 曉， 徐艷霞， 劉俊杰， 等. 芽孢桿菌在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 土壤與作物， 2019， 8（1）： 32-42.

[58] 祁? 超， 寸海春， 何鵬飛， 等. 生防菌YN201490在黃瓜植株體內(nèi)的定殖能力及防病機(jī)制的初步研究[J]. 云南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2019， 41（1）： 172-180.

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