林顯祖，肖小虎，陽江華，秦云霞，龍翔宇，方永軍

摘? 要：鈣調(diào)蛋白結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子（Calmodulin-binding transcription activator， CAMTA）是一類存在于真核生物中結(jié)構(gòu)保守的重要鈣調(diào)素結(jié)合蛋白，廣泛參與植物的脅迫應(yīng)答、生長發(fā)育及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程。本文以巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）為研究對(duì)象，從全基因組水平鑒定到8個(gè)橡膠樹HbCAMTA基因，并對(duì)這些基因的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控元件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，該基因家族所有成員均定位于細(xì)胞核內(nèi)，編碼蛋白均為親水性蛋白，分子量在104.34～121.99 kD之間，等電點(diǎn)在5.32～7.83之間;家族基因根據(jù)蛋白序列同源性可以分成4個(gè)亞組，亞組成員在基因結(jié)構(gòu)、保守基序數(shù)目和相對(duì)位置等方面具有較高相似性。調(diào)控HbCAMTA的miRNA預(yù)測(cè)分析顯示，每個(gè)家族成員受到至少3個(gè)miRNA調(diào)控。表達(dá)分析結(jié)果顯示，HbCAMTA在不同組織的表達(dá)有明顯的差異，在葉片中隨著葉片的發(fā)育表達(dá)不斷上調(diào)，在成熟期或變色期達(dá)到最高的表達(dá)水平;除HbCAMTA2外，乙烯刺激未能顯著誘導(dǎo)橡膠樹其他CAMTA基因的表達(dá)，而低溫可以顯著誘導(dǎo)HbCAMTA的上調(diào)表達(dá)。HbCAMTA1是膠乳、葉片、根、樹皮、雄花、雌花以及葉片整個(gè)發(fā)育過程（古銅期、變色期、淡綠期、成熟期）中最高表達(dá)的基因家族成員，表明其具有非組織特異性的基礎(chǔ)生物學(xué)功能。HbCAMTA3在種子中表達(dá)水平最高且受低溫脅迫誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá)，表明其在響應(yīng)低溫脅迫過程中具有重要的作用。HbCAMTA7在大多數(shù)組織、乙烯處理、低溫脅迫處理以及葉片不同發(fā)育時(shí)期均是最低表達(dá)。本研究初步揭示了橡膠樹CAMTA家族成員的理化特征和表達(dá)特性，為進(jìn)一步闡明該基因功能奠定了重要的基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：巴西橡膠樹;轉(zhuǎn)錄因子;CAMTA;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)：S794.1? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Genome-wide Identification and Expression Analysis of the CAMTA Family in Rubber Tree （Hevea brasiliensis）

LIN Xianzu1，2， XIAO Xiaohu2， YANG Jianghua2， QIN Yunxia2， LONG Xiangyu2， FANG Yongjun2*

1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Institute of Rubber Research， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： Calmodulin-binding transcription activators （CAMTAs） are important proteins with a conserved calmodulin- binding domain， which are widely involved in biological processes such as stress response， growth and development， and hormone signalling in plant. In this study， we identified eight HbCAMTAs screening the genome-wide of the rubber tree and analyzed physicochemical properties， gene structures， regulatory elements， gene expression patterns， and so on. The results showed that all HbCAMTAs were located in the nucleus， and predicted as hydrophilic proteins with molecular weight from 104.34 to 121.99 kD and isoelectric points between 5.32 and 7.83. The sequence homology analysis showed that HbCAMTAs could be divided into four subclades， and each one had similar gene structure， conserved domains. Furthermore， each HbCAMTA was potentially regulated by at least three miRNAs. Expression analysis indicated that the expression of HbCAMTAs differed significantly in different tissues， and the expression was continuously up-regulated in leaves with the development of leaves and reached the highest expression level at mature or palegreen. Except for HbCAMTA2， ethylene stimulation failed to significantly induce the expression of other CAMTA genes in rubber tree while low-temperature could significantly induce the up-regulated expression of HbCAMTAs. HbCAMTA1 was constitutively expressed in all samples， and also mostly expressed in latex， leaves， roots， bark， male and female flowers， and four different leaf developmental stages （Bronzite， Changecolor， Palegreen， and Mature）， which suggesting its fundamental function in rubber tree. HbCAMTA3 was expressed at the highest level in the seeds and was significantly up-regulated by low temperature stress， indicating its important role in response to low temperature stress. HbCAMTA7 was undetectably express in all investigated samples including different tissues， leaf developments， and treatments. Finally， this study would provide important information for further revealing the function of HbCAMTAs in rubber tree.

Keywords： Hevea brasiliensis; transcription factor; CAMTA; gene expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.015

鈣離子（Ca2+）是一種廣泛存在于植物中的重要的第二信使，在植物的生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要的作用。鈣調(diào)蛋白（Calmodulin，CaM）作為植物中重要的鈣離子（Ca2+）結(jié)合蛋白之一，廣泛存在于植物當(dāng)中。CaM在細(xì)胞中主要負(fù)責(zé)感知Ca2+濃度變化，進(jìn)而達(dá)到傳遞Ca2+信號(hào)的目的，從而在諸多生理生化調(diào)節(jié)過程中扮演重要的角色[1]。Ca2+-CaM信號(hào)系統(tǒng)在植物調(diào)控抗病抗逆過程中起著重要作用，參與活性氧的產(chǎn)生[2]、過敏性壞死反應(yīng)[3]、蛋白質(zhì)磷酸化過程及PR基因表達(dá)[4]的調(diào)節(jié)。

目前，植物中已經(jīng)鑒定出90多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子為Ca2+/CaM結(jié)合蛋白，其中包括CAMTA、MYB、WRKY、NAC、bZIP等基因家族[5-9]。鈣調(diào)蛋白結(jié)合的轉(zhuǎn)錄激活子（CaM-binding transcription activator，CAMTA）是一類能夠與CaM結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子[4， 10-11]，廣泛存在于植物中，在生長發(fā)育、生物脅迫和非生物脅迫響應(yīng)，特別是在冷脅迫方面起重要作用。模式植物擬南芥中研究表明AtCAMTA3具有包括CBF2在內(nèi)的10個(gè)相互作用因子，正調(diào)控參與冷應(yīng)激基因CBF2的表達(dá)[12]，AtCAMTA1和AtCAMTA3雙突變體對(duì)冷凍的耐受性明顯降低[13]。玉米中研究表明ZmCAMTA4a、ZmCAMTA7a和ZmCAMTA7b通過冷脅迫處理在芽中顯著上調(diào)表達(dá)，只有ZmCAMTA4a在根中受冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[14]。

巴西橡膠樹是目前商業(yè)天然橡膠的重要來源，在生產(chǎn)過程中受到多種脅迫威脅，其中低溫寒害是我國作為非傳統(tǒng)植膠區(qū)面臨的最大危害。低溫會(huì)引起橡膠樹長時(shí)間排膠，形成“長流”現(xiàn)象?！伴L流”易誘發(fā)橡膠樹發(fā)生死皮，不利于天然橡膠的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)。在模式植物擬南芥中的研究表明，CAMTA基因家族成員參與了低溫脅迫的應(yīng)答過程并調(diào)控相關(guān)冷應(yīng)激基因的表達(dá)。而在橡膠樹中并未見相關(guān)研究報(bào)道，因而對(duì)于橡膠樹CAMTA基因研究有助于揭示CAMTA基因在橡膠樹低溫脅迫響應(yīng)中的作用，所以了解橡膠樹抗寒機(jī)制具有重要的意義。本文以橡膠樹基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，全面鑒定了橡膠樹8個(gè)CAMTA基因家族成員，利用生物信息學(xué)方法分析CAMTA家族成員的基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、啟動(dòng)子元件、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化和表達(dá)水平。本研究將為進(jìn)一步深入解析橡膠樹CAMTA基因功能奠定重要的基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? HbCAMTA基因家族成員全基因組鑒定

參考PlantTFdb提供的CAMTA轉(zhuǎn)錄因子家族定義規(guī)則（http：//planttfdb.gao-lab.org/help_ famsc-hema.php），獲得用于該家族成員鑒定的DNA結(jié)合域CG1（PF03859），然后從PFAM數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）下載該結(jié)合域的隱馬爾可夫模型（hidden Markov model， HMM）文件，利用HMMER3.3（http：//hmmer.org/）程序搜索橡膠樹基因組數(shù)據(jù)庫中所有蛋白序列，從全基因組水平預(yù)測(cè)橡膠樹所有CAMTA基因家族成員。同時(shí)，從PlantTFdb數(shù)據(jù)庫下載擬南芥CAMTA蛋白序列（AtCAMTA1：AT5G09410.1、AT5G09410.2、AT5G09410.3;AtCAMTA2：AT5G64220.1、AT5G64220.2;AtCAMTA3：AT2G22300.1、AT2G22300.2;AtCAMTA4：AT1G67310.1;AtCAMTA5：AT4G16150.1;AtCAMTA6：AT3G16940.1）作為參考序列，采用blastp程序到HeveaDB數(shù)據(jù)庫（http：//hevea.catas. cn/home/index）進(jìn)行比對(duì)檢索同源基因。將2種方法得到的基因集進(jìn)行去冗余后，進(jìn)一步通過NCBI的Batch Web CD-search Tool （https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，最終將含有該家族典型的結(jié)構(gòu)域的蛋白序列鑒定為橡膠樹CAMTA家族成員（HbCAMTA）。

1.2? HbCAMTA基因家族成員基本理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

利用在線網(wǎng)站Plant-mPLoc（http：//www.csbio. sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預(yù)測(cè)HbCAMTA的亞細(xì)胞定位;利用在線工具ExPASy ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）計(jì)算蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量。

1.3? HbCAMTA基因結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域和Motif的分析

根據(jù)橡膠樹基因組的注釋信息，利用TBtools（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools）繪制HbCAMTA基因結(jié)構(gòu)圖;利用NCBI Batch CD- search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ bwrpsb/bwrpsb.cgi）搜索序列保守結(jié)構(gòu)域，然后通過IBS （http：//ibs.biocuckoo.org/）進(jìn)行圖形化展示;利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/ meme）在線服務(wù)預(yù)測(cè)CAMTA家族基因的保守motif。

1.4? 多序列聯(lián)配和系統(tǒng)進(jìn)化分析

從PlantTFdb（http：//planttfdb.gao-lab.org/ index.php）數(shù)據(jù)庫和NCBI（https：//www.ncbi.nlm. nih.gov/）數(shù)據(jù)庫下載擬南芥、蓖麻、木薯、胡楊、毛果楊、麻風(fēng)樹和亞麻的CAMTA蛋白序列與HbCAMTA組成分析蛋白序列集，先用Cluster軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，再利用MEGA X軟件采用鄰接法（neighbor-joining method，NJ）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建，bootstrap取1 000。

1.5? 調(diào)控HbCAMTA基因的miRNA預(yù)測(cè)

通過psRNATarget在線軟件（http：//plantgrn. noble.org/psRNATarget/）對(duì)調(diào)控橡膠樹CAMTA基因家族成員的miRNA進(jìn)行預(yù)測(cè)，設(shè)定參數(shù)Expect值為3.5，UPE值為15。預(yù)測(cè)可能參與調(diào)控HbCAMTA的miRNA。

1.6? HbCAMTA家族成員表達(dá)分析

利用本實(shí)驗(yàn)室已有的Solexa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，對(duì)不同組織、乙烯處理不同時(shí)間、低溫脅迫處理不同時(shí)間和葉片不同發(fā)育時(shí)期的HbCAMTA基因家族成員的表達(dá)模式進(jìn)行分析，并以熱圖形式對(duì)結(jié)果進(jìn)行展示。

1.7? HbCAMTA家族成員啟動(dòng)子順式作用元件分析

截取HbCAMTA轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 kb的序列作為啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析，利用在線軟件PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webt?o-ols/plantcare/html/）預(yù)測(cè)啟動(dòng)子序列的順式作用元件，通過TBtools軟件對(duì)預(yù)測(cè)的結(jié)果進(jìn)行可視化展示。

2? 結(jié)果與分析

2.1? HbCAMTA家族成員鑒定與理化性質(zhì)分析

用隱馬爾可夫模型預(yù)測(cè)得到8個(gè)橡膠樹候選CAMTA基因家族成員，利用蛋白序列同源比對(duì)獲得候選HbCAMTA基因家族成員14個(gè)，去冗余后共16個(gè)，進(jìn)一步通過保守結(jié)構(gòu)域分析，最終鑒定獲得8個(gè)橡膠樹CAMTA成員基因，分別命名為HbCAMTA1-8。橡膠樹CAMTA編碼的蛋白序列長度基本相似，在923～1086個(gè)氨基酸之間，HbCAMTA5編碼的蛋白序列最長，達(dá)到了1086個(gè)氨基酸，而HbCAMTA1編碼的蛋白序列最短，只有923個(gè)氨基酸。利用ExPASy ProtParam在線工具對(duì)橡膠樹CAMTA基因編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明HbCAMTA蛋白的理化特性具有多樣性，其分子量在104.34～121.99 kD之間，等電點(diǎn)在5.32～7.83之間，其中7個(gè)HbCAMTA蛋白等電點(diǎn)小于7.0，只有HbCAMTA2的等電點(diǎn)大于7，說明多數(shù)HbCAMTA基因編碼弱酸性蛋白（表1）。亞細(xì)胞定位的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示所有CAMTA蛋白均不含信號(hào)肽，定位在細(xì)胞核。親水性平均系數(shù)是衡量蛋白親疏水性的重要指標(biāo)，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示8個(gè)橡膠樹HbCAMTA蛋白的親水性平均系數(shù)在-0.574～-0.384之間，表明橡膠樹所有CAMTAs蛋白都是親水性蛋白。

2.2? HbCAMTA基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

根據(jù)Tang等[15]發(fā)表的基因組結(jié)構(gòu)注釋信息，利用TBtools軟件分析HbCAMTA家族成員的基因結(jié)構(gòu)并繪制該基因家族的基因結(jié)構(gòu)圖（圖1），我們發(fā)現(xiàn)鑒定到HbCAMTA成員均含有11～12個(gè)內(nèi)含子不等。HbCAMTA1和HbCAMTA7，?HbCAMTA3和HbCAMTA8，HbCAMTA4和HbCAMTA6組成了3個(gè)同源基因?qū)?，每個(gè)同源基因?qū)邢嗤耐怙@子數(shù)量和內(nèi)含子數(shù)量，且每個(gè)外顯子長度相似，而內(nèi)含子長度差異明顯，主要體現(xiàn)在第1個(gè)和第3個(gè)內(nèi)含子，同源基因?qū)χg在基因結(jié)構(gòu)上具有較高的相似性，暗示著CAMTA基因結(jié)構(gòu)具有保守性。保守結(jié)構(gòu)域分析表明，HbCAMTA1、HbCAMTA2、HbCAMTA4、HbCAMTA6、HbCAMTA8五個(gè)基因均含有保守的CG-1結(jié)構(gòu)域、IQ結(jié)構(gòu)域、Ank_2結(jié)構(gòu)域和TIG結(jié)構(gòu)域，HbCAMTA3含有保守的CG-1結(jié)構(gòu)域、Ank_2結(jié)構(gòu)域和TIG結(jié)構(gòu)域，不含有IQ結(jié)構(gòu)域，HbCAMTA5含有保守的CG-1結(jié)構(gòu)域、IQ結(jié)構(gòu)域和TIG結(jié)構(gòu)域，不含有Ank_2結(jié)構(gòu)域，HbCAMTA7含有保守的CG-1結(jié)構(gòu)域、IQ結(jié)構(gòu)域和ANKYR結(jié)構(gòu)域，不含有TIG結(jié)構(gòu)域（圖2）。

2.3? HbCAMTA家族成員的保守基序分析

利用在線工具M(jìn)EME Suite 5.1.1對(duì)HbCAMTA蛋白的保守基序進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，HbCAMTA蛋白包含了10個(gè)保守的基序，分別命名為Motif 1-10。在10個(gè)基序中，Motif 6是未知的，Pfam數(shù)據(jù)庫未能找到對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)域，該基序的功能還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明。Motif 1、Motif 4和Motif 10與CG-1結(jié)構(gòu)域相關(guān)，而Motif 3與ANK結(jié)構(gòu)域相關(guān)。Motif 2和Motif 7與IQ結(jié)構(gòu)域相關(guān)，而Motif 5和Motif 8與TIG結(jié)構(gòu)域相關(guān)。圖3顯示了所有已確定的基序的序列標(biāo)志圖。

2.4? HbCAMTA家族成員進(jìn)化分析

從PlantTFdb和NCBI數(shù)據(jù)庫分別下載木薯（6個(gè)）、蓖麻（5個(gè)）、胡楊（7個(gè)）、毛果楊（7個(gè)）、麻風(fēng)樹（4個(gè)）、擬南芥（6個(gè)）和亞麻（9個(gè)）的CAMTA氨基酸序列，結(jié)合本研究鑒定到的8個(gè)橡膠樹CAMTA氨基酸序列，組成共計(jì)52個(gè)植物CAMTA蛋白的序列集，利用MEGA X構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖4顯示，CAMTA基因家族可以分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4個(gè)亞組。HbCAMTA家族成員在4個(gè)亞組均有分布，且在同一分枝上與木薯MeCAMTA基因聚在一起，這與物種系統(tǒng)進(jìn)化上橡膠與木薯親緣關(guān)系最近相一致。Ⅰ亞組主要包括HbCAMTA4、MeCAMTA4、AtCAMTA4等;Ⅱ亞組主要包括HbCAMTA1、HbCAMTA7、MeCAMTA1、AtCAMTA5、AtCAMTA6等;Ⅲ亞組主要包括HbCAMTA2、MeCAMTA2等;Ⅳ亞組主要包括HbCAMTA3、HbCAMTA8、HbCAMTA5、MeCAMTA3、MeCAMTA5、AtCAMTA1、AtCAMTA2、AtCAMTA3等。另外，系統(tǒng)進(jìn)化顯示存在HbCAMTA1和HbCAMTA7，HbCAMTA3和HbCAMTA8，HbCAMTA4和HbCAMTA6三個(gè)同源基因?qū)?，這與基因結(jié)構(gòu)和序列同源性分析結(jié)果一致。

2.5? 調(diào)控HbCAMTA基因的miRNA分析

利用在線軟件psRNATarget，以HbCAMTA 基因的cDNA序列作為靶基因，對(duì)植物的small RNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，結(jié)果見表2，HbCAMTA基因家族成員均有3個(gè)及以上的miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。HbCAMTA6只有3個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，而HbCAMTA2和HbCAMTA8各有10個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。HbCAMTA3受到9個(gè)miRNA調(diào)控，?擬南芥：AtCAMTA1-6;橡膠樹：HbCAMTA1-8;蓖麻：RCOM_0213350、RCOM_0999870、RCOM_1002900、RCOM_1079700、RCOM_1296350;毛果楊：PtCAMTA1-7;胡楊：CCG000518.1、CCG020006.1、CCG020717.1、CCG023491.1、CCG025222.1、CCG025313.1、CCG031532.1;木薯：MeCAMTA1-6;亞麻：LuCAMTA1-9;麻風(fēng)樹：JCGZ_19069、JCGZ_18971、JCGZ_24032、JCGZ_20177。

其中最多的是屬于miR159家族的成員。結(jié)果暗示了miRNA可能在參與調(diào)控HbCAMTA的表達(dá)方面具有重要作用。

2.6? HbCAMTA家族成員轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

為了解橡膠樹CAMTA基因的表達(dá)特性，我們利用本實(shí)驗(yàn)室已有的Solexa轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，對(duì)不同組織、葉片不同發(fā)育時(shí)期、低溫脅迫處理以及乙烯處理膠乳中的家族成員進(jìn)行表達(dá)分析。結(jié)果顯示（圖5），HbCAMTA1是橡膠樹CAMTA家族主要功能基因，在所檢測(cè)的7個(gè)組織（膠乳、葉片、根、雄花、雌花、樹皮、種子）、葉片的4個(gè)發(fā)育時(shí)期（古銅期、變色期、淡綠期、成熟期）、低溫脅迫處理3個(gè)時(shí)間點(diǎn)以及乙烯處理4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有表達(dá)，且整體表達(dá)水平較高。特別是在葉片發(fā)育過程中和低溫脅迫處理下明顯上調(diào)表達(dá)，推測(cè)該基因?yàn)榻M成型表達(dá)，且在葉片發(fā)育過程中和響應(yīng)低溫脅迫起重要作用。HbCAMTA3在種子中表達(dá)水平最高，其次是樹皮中，其受低溫脅迫誘導(dǎo)明顯地持續(xù)上調(diào)表達(dá)且最顯著。在乙烯處理膠乳中HbCAMTA整體表達(dá)水平相對(duì)較低，HbCAMTA1呈現(xiàn)下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，HbCAMTA2和HbCAMTA8呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)。低溫脅迫下，HbCAMTA1、HbCAMTA2、HbCAMTA3、HbCAMTA4、HbCAMTA5、HbCAMTA6、HbCAMTA8均受低溫誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)。HbCAMTA7基因在所有檢測(cè)樣品中表達(dá)水平均為最低甚至不表達(dá)，從該結(jié)果可以推測(cè)HbCAMTA1和HbCAMTA7在進(jìn)化過程中出現(xiàn)了功能分化，HbCAMTA1在橡膠樹生長發(fā)育等方面具有重要功能，而HbCAMTA7出現(xiàn)了去功能化。

綜上結(jié)果表明，橡膠樹HbCAMTA基因家族成員在組織表達(dá)、乙烯處理的響應(yīng)和葉片不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)方面存在明顯差異，反映了橡膠樹HbCAMTA基因功能的多樣性，而在低溫脅迫的表達(dá)方面具有一定的一致性。

2.7? HbCAMTA家族成員啟動(dòng)子順式作用元件的分析

分別截取8個(gè)HbCAMTA基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2000 bp序列作為啟動(dòng)子區(qū)序列，利用PlantCARE在線工具對(duì)啟動(dòng)子區(qū)上可能存在的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到位于啟動(dòng)子區(qū)域的多種順式作用元件（圖6），包括脫落酸響應(yīng)元件（14個(gè)）、逆境脅迫誘導(dǎo)（2個(gè)）、赤霉素誘導(dǎo)（8個(gè)）、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件（18個(gè)）、光響應(yīng)元件（58個(gè)）、水楊酸響應(yīng)元件（2個(gè)）、干旱響應(yīng)元件（3個(gè)）、厭氧誘導(dǎo)元件（14個(gè)）等，表明HbCAMTA參與多種植物激素和環(huán)境脅迫應(yīng)答。HbCAMTA中的6個(gè)基因（HbCAMTA1、HbCAMTA2、HbCAMTA3、HbCAMTA4、HbCAMTA7和HbCAMTA8）的啟動(dòng)子區(qū)上擁有茉莉酸甲酯響應(yīng)元件。除了HbCAMTA7之外，HbCAMTA中的7個(gè)基因在啟動(dòng)子區(qū)上都有厭氧誘導(dǎo)元件。所有的HbCAMTA都擁有光響應(yīng)元件。HbCAMTA2、HbCAMTA4、HbCAMTA5、HbCAMTA7和HbCAMTA8五個(gè)基因擁有脫落酸響應(yīng)元件;HbCAMTA2和HbCAMTA5擁有干旱響應(yīng)元件;HbCAMTA6和HbCAMTA7擁有水楊酸響應(yīng)元件。

3? 討論

CaM是一種重要的Ca2+結(jié)合蛋白，通過生物化學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)手段證明具有明確的生物學(xué)作用，是一種與多種靶蛋白結(jié)合的調(diào)節(jié)因子[11， 16-17]。CAMTA、WRKY、MYB和bZIP等轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被證明通過與CaMs/CMLs相互作用來響應(yīng)不同的生物和非生物脅迫[18-20]。

Latex：膠乳;Leaf：葉片;Root：根;Bark：樹皮;Female flower：雌花;Male flower：雄花;Seed：種子;ET-0h：乙烯處理0 h;ET-3h：乙烯處理3 h;ET-12h：乙烯處理12 h;ET-24h：乙烯處理24 h;Bronzite：古銅期;Changecolor：變色期;Palegreen：淡綠期;Mature：成熟期;4C-0h：低溫脅迫（4 ℃）處理0 h;4C-6 h：低溫脅迫（4 ℃）處理6 h;4C-12 h：低溫脅迫（4 ℃）處理12 h。

CAMTA轉(zhuǎn)錄因子在鈣/鈣調(diào)素轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路和CAMTA介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這是植物對(duì)外源激素和非生物脅迫做出反應(yīng)的關(guān)鍵過程[21-24]。橡膠樹發(fā)育具有明顯的特異性（乳管），生產(chǎn)過程受到多種生物及非生物脅迫以及激素刺激，推測(cè)CAMTA可能發(fā)揮重要生物學(xué)功能。2016年Tang等[15]完成橡膠樹基因組測(cè)序，使得我們能夠?qū)bCAMTA進(jìn)行全面地分析。在本研究中，我們對(duì)橡膠樹的CAMTA基因進(jìn)行了全基因組水平的鑒定，并從理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、調(diào)控因子以及轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式等方面進(jìn)行分析。

橡膠樹中鑒定到8個(gè)CAMTA基因，略多于擬南芥（6個(gè)）[25]、木薯（6個(gè)）[26]和毛果楊（7個(gè)）[27]的，而比同屬金虎尾目下的亞麻（9個(gè)）[28]少一個(gè)。我們采用基于隱馬爾可夫模型的HMMER軟件和blastp程序從全基因組水平進(jìn)行鑒定橡膠樹的CAMTA成員，并取二者輸出的結(jié)果交集進(jìn)一步進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，最終將含有CG-1結(jié)構(gòu)域的確認(rèn)橡膠樹的CAMTA成員。HMMER軟件是基于隱馬爾可夫模型構(gòu)建的HMM文件，利用概率推理方法和隱馬爾可夫模型（HMM）進(jìn)行同源搜索，常用于同源蛋白的識(shí)別。同源過度擴(kuò)展[29]和收斂進(jìn)化[30]是序列比對(duì)程序錯(cuò)誤地識(shí)別蛋白質(zhì)同源關(guān)系的重要因素，Mistry等[31]使用Bateman等[32]收集的配置文件-HMMs測(cè)試HMMER3分配蛋白質(zhì)序列到同源家族的準(zhǔn)確性，結(jié)果表明假陽性率在1%～2%之間。同時(shí)，我們用擬南芥的CAMTA家族成員蛋白序列進(jìn)行blastp，然后取HMMER和blastp輸出結(jié)果的交集，可有效避免因?yàn)槌绦蛩惴ㄒ鸬募訇栃越Y(jié)果和假陰性結(jié)果，并通過保守結(jié)構(gòu)域分析再次驗(yàn)證了鑒定結(jié)果的可靠性。

基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)橡膠樹CAMTA同源基因?qū)哂休^高的相似性，暗示著橡膠樹同擬南芥、毛果楊、玉米和木薯等物種一樣表現(xiàn)為基因結(jié)構(gòu)具有較高的保守性[14， 25-27]。內(nèi)含子相對(duì)位置在同一分支中也具有保守性，而不同分支中則存在差異。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示CAMTA可以分為4個(gè)亞組，其他物種一般分為4個(gè)或3個(gè)亞組，例如亞麻（3個(gè)）[28]、玉米（4個(gè)）[14]、毛果楊（3個(gè)）[27]、小麥（3個(gè)）[33]，擬南芥CAMTA在其他的物種系統(tǒng)進(jìn)化分組中的分布與在本次系統(tǒng)進(jìn)化分組中的分布是一致的，因此橡膠樹CAMTA分為4個(gè)亞組具有合理性。橡膠樹和木薯的CAMTA高度同源具有較近的親緣關(guān)系，這與二者同屬大戟科植物，進(jìn)化距離較近相一致。HbCAMTA3和MeCAMTA3處在同一分枝上并與HbCAMTA5、HbCAMTA8、AtCAMTA1、AtCAMTA2和AtCAMTA3處在同一個(gè)亞組。該分支中的擬南芥CAMTA成員生物學(xué)功能已經(jīng)進(jìn)行了充分研究，AtCAMTA3是一個(gè)響應(yīng)低溫脅迫的轉(zhuǎn)錄因子，在低溫脅迫下通過正調(diào)控在植物低溫脅迫發(fā)揮重要作用的CBF2基因[21]和調(diào)控水楊酸（salicylic acid， SA）合成[13]發(fā)揮作用，而橡膠樹中HbCAMTA3受低溫脅迫誘導(dǎo)顯著持續(xù)上調(diào)表達(dá)，推測(cè)HbCAMTA3可能通過類似AtCAMTA3的生化反應(yīng)在橡膠樹的低溫脅迫中發(fā)揮作用。同時(shí)AtCAMTA3還是一個(gè)鹽脅迫[34]響應(yīng)因子，暗示了HbCAMTA3可能也具有功能多樣性。Galon等[10]通過基因芯片進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)， AtCAMTA1突變體中有17個(gè)與生長素相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)，AtCAMTA1突變體和RNAi介導(dǎo)的CAMTA1抑制型轉(zhuǎn)基因株系的下胚軸伸長都表現(xiàn)出對(duì)生長素超敏的表型，認(rèn)為擬南芥AtCAMTA1參與生長素信號(hào)傳導(dǎo)途徑并調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育。Yang等[35]在番茄中發(fā)現(xiàn)7個(gè)CAMTA基因在果實(shí)發(fā)育和成熟過程中差異表達(dá)，可能參與番茄果實(shí)的發(fā)育和成熟過程的調(diào)控，推測(cè)橡膠樹中CAMTA同源基因參與了組織和器官的生長發(fā)育過程。擬南芥中的研究表明AtCAMTA2是 AtALMT1（鋁激活的蘋果酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1）的激活轉(zhuǎn)錄因子[36]，AtCAMTA3在SA介導(dǎo)的植物防衛(wèi)反應(yīng)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用[23， 37-38]，AtCAMTA1、AtCAMTA2和AtCAMTA3 喪失阻遏作用能誘導(dǎo)植物防御基因和系統(tǒng)抗性的啟動(dòng)[39]，木薯中MeCAMTA3通過調(diào)控木薯-黃單胞菌相互作用過程中的多種免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)木薯細(xì)菌性枯萎病的抗性[26]。因此，我們推測(cè)橡膠樹HbCAMTA3、HbCAMTA5和HbCAMTA8基因具有功能多樣性，可能參與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長發(fā)育調(diào)節(jié)、低溫脅迫響應(yīng)、鹽脅迫和防衛(wèi)反應(yīng)等過程，而其中HbCAMTA3基因是我們進(jìn)一步研究橡膠樹響應(yīng)低溫脅迫分子機(jī)制的重要候選基因之一。本研究首次對(duì)橡膠樹中CAMTA基因進(jìn)行系統(tǒng)分析，將為后續(xù)進(jìn)一步研究HbCAMTA基因在橡膠樹中的功能奠定基礎(chǔ)。

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責(zé)任編輯：孫海燕