王星 徐薪璐 卞麗麗 姚文靜 林樹燕

摘要：對彩葉觀賞竹種靚竹進行組培快繁研究，以不同季節(jié)采集的靚竹鞭芽為試驗材料，對其進行最佳滅菌時間篩選，尋求初代培養(yǎng)、繼代增殖培養(yǎng)、生根誘導(dǎo)培養(yǎng)過程中最佳植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合，確定移栽馴化最佳基質(zhì)，從而建立高效組培快繁體系。結(jié)果表明，靚竹最佳采樣季節(jié)為8—9月，最佳滅菌處理為75%乙醇30 s→無菌水沖洗3～5次→2%次氯酸鈉溶液處理15 min→無菌水沖洗3～5次→濾紙吸干水分接種，滅菌率達67.21%;靚竹叢芽誘導(dǎo)及增殖過程中，利用6-BA、KT、NAA、TDZ不同組合進行正交試驗，篩選出最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT，誘導(dǎo)率達87.57%，最佳增殖培養(yǎng)基為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L TDZ，增殖系數(shù)達5.05;靚竹叢芽增殖過程中可同時生根，最佳生根培養(yǎng)基與增殖培養(yǎng)基相同，生根組培苗開蓋煉苗7 d后，移栽至基質(zhì)為壤土 ∶草炭土=2 ∶1中，成活率可達95%，幼苗長勢良好。

關(guān)鍵詞：靚竹;鞭芽;組織培養(yǎng);煉苗移栽

中圖分類號：S795.904?? 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0064-07

收稿日期：2021-06-03

基金項目：江蘇省林業(yè)科技創(chuàng)新與推廣項目（編號：LYKJ[2019]29）;江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項目（編號：PAPD）。

作者簡介：王 星（1995—），女，江西九江人，碩士，主要研究方向為竹類植物種質(zhì)資源篩選。E-mail：1519814680@qq.com。

通信作者：林樹燕，博士，教授，主要從事觀賞竹種質(zhì)篩選和快速繁育研究。E-mail：lrx@njfu.com.cn。

靚竹（Sasaella glabra f. albostriata），中文學(xué)名為白紋椎谷笹，禾本科，東笆竹屬，混生型竹種。竹株矮小，株間密集，分蘗力強，葉片綠色具黃白色縱條紋，色彩優(yōu)美，經(jīng)常作為觀賞竹種被人們所認(rèn)識。由于竹類植物開花間隔期長，很少開花結(jié)實，且竹類植物花粉萌發(fā)率普遍較低，因此種子獲取十分困難。目前竹子繁殖主要以移竹、竹蔸、埋鞭、埋稈、埋節(jié)等傳統(tǒng)方法為主，這些方法具有消耗母竹多、種苗運輸不便、勞動強度大、繁殖系數(shù)低等缺點，尤其對資源稀少的珍貴觀賞竹種來說，傳統(tǒng)的繁殖方法受到了較大限制，難以快速規(guī)?；l(fā)展資源。針對這些問題，隨著對竹類研究的深化，人們開始研究竹類植物新的繁殖方法，其中最直觀有效的就是竹類組織培養(yǎng)獲得再生植株。

當(dāng)前對于靚竹的研究主要集中在其抗旱性[1]、抗性生理研究[2]、花葉變異機制的研究[3]、葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘难芯縖4]、高生長規(guī)律[5]、光合特性研究[6、7]、葉片結(jié)構(gòu)[8、9]、引種適應(yīng)性[10]等方面，而對于靚竹組織培養(yǎng)的研究還未見報道。以芽繁芽途徑?jīng)]有通過脫分化與再分化過程，一般能保持品種特性穩(wěn)定不變異，是植物組培快繁最常用的方法。目前，竹子組織培養(yǎng)多采用以芽繁芽途徑，且大多數(shù)均采用帶芽莖段為外植體，而通過以鞭芽為外植體繁芽的報道較少，僅見于Prutpongse等的少數(shù)研究[11]中，本研究初次使用靚竹鞭芽為外植體，建立靚竹組培快繁體系，填補了靚竹以芽繁芽的空白，可為其他觀賞竹的快繁研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為南京林業(yè)大學(xué)白馬苗圃繁育基地生長旺盛、莖稈較多、花葉繁茂的盆栽靚竹苗，采樣時間為2019年1—12月。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理

將靚竹從容器中取出，去除土壤，洗凈地下莖部分，將帶有萌動或休眠芽的長鞭剪成每段1～2 cm的帶芽鞭段，放在培養(yǎng)瓶中，洗潔精浸泡5 min后流水下沖洗2～3 h。

1.2.2 外植體消毒

在沖洗好的鞭芽中添加5～10滴吐溫80，不斷攪拌，時間持續(xù)5～8 min，流水下沖洗干凈，轉(zhuǎn)至超凈工作臺上備用。利用消毒試劑75%乙醇不同處理（30、45、60 s）及2%次氯酸鈉溶液不同處理（12、15、17 min）進行組合，對靚竹鞭芽進行消毒滅菌，每次消毒結(jié)束后用無菌水沖洗外植體3～5次，無菌濾紙吸干水分。將消毒后的靚竹鞭芽接種在培養(yǎng)基MS+3 mg/L 6-BA中，每個處理接種15瓶，每瓶2個外植體，重復(fù)3次，20 d后統(tǒng)計污染率，30 d后統(tǒng)計死亡率及無菌成活率，確定最佳消毒方法。污染率=（污染外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%;死亡率=（死亡外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%;成活率=（成活外植體數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%

1.2.3 初代誘導(dǎo)培養(yǎng)

經(jīng)最佳消毒方式獲得靚竹無菌鞭芽后，將其接種在不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合的培養(yǎng)基中，進行叢芽的誘導(dǎo)。本試驗選擇3種不同濃度的6-BA、KT、NAA組合進行叢芽誘導(dǎo)，試驗按照正交設(shè)計L9（34）（表1），每個處理接種15瓶，每瓶2個外植體，重復(fù)3次，35 d后統(tǒng)計叢芽個數(shù)，計算誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率=（無菌外植體啟動數(shù)/接種外植體總數(shù)）×100%。

1.2.4 繼代增殖與生根培養(yǎng)

將誘導(dǎo)出的芽接種至繼代培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)。本試驗選擇不同濃度的6-BA、KT、TDZ組合進行叢芽增殖，試驗按照正交設(shè)計L9（34）（表2），每種濃度組合15瓶，每瓶接種2個外植體，重復(fù)3次，觀察周期為45 d，統(tǒng)計叢芽增殖系數(shù)。增殖過程中叢生芽出現(xiàn)生根現(xiàn)象，記錄各不同處理下叢生芽不定根的生長情況，統(tǒng)計生根率。增殖系數(shù)=繼代后芽苗總數(shù)/繼代前的芽苗總數(shù)，生根率=（生根的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%。

1.2.5 移栽馴化

生根培養(yǎng)一段時間后，選取生長健康、根系發(fā)育較為良好的的靚竹組培苗， 在培養(yǎng)室的散光下進行開口煉苗，然后移栽至不同基質(zhì)中，移栽前對基質(zhì)進行消毒處理，選用0.1%高錳酸鉀對基質(zhì)進行噴灑消毒滅菌。不同基質(zhì)配方為100%壤土、壤土 ∶草炭土=1 ∶1、壤土 ∶草炭土=2 ∶1、壤土 ∶蛭石=1 ∶1、壤土 ∶蛭石 ∶草炭土=1 ∶1 ∶1，移栽后葉面經(jīng)常澆水，保持空氣濕度在70%～90%之間，溫度為22～28 ℃之間，觀察生長情況，統(tǒng)計成活率，比較不同基質(zhì)對移栽成活率的影響。

1.3 培養(yǎng)條件

試驗過程中培養(yǎng)基pH值的范圍控制在5.75～5.80之間，蔗糖濃度30 g/L，瓊脂含量為2.25 g/L。培養(yǎng)溫度（25±1） ℃，光照度1 200～1 500 lx，光照時長14 h/d。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果選擇Microsoft Excel 2010和SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和差異顯著性檢驗，小寫字母表示在0.05水平差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳消毒時間的選擇

靚竹鞭芽消毒滅菌結(jié)果見表3，當(dāng)乙醇滅菌時間相同時，次氯酸鈉不同處理時間對鞭芽的滅菌效果不同：在乙醇處理時間為30 s時，不同次氯酸鈉處理時間下鞭芽污染率及成活率出現(xiàn)顯著性差異，處理時間為15 min時，鞭芽的污染率最低，僅為12.15%，成活率最高，為67.21%，17 min時死亡率最高，為36.27%;當(dāng)乙醇處理時間為45 s時，不同次氯酸鈉處理時間下鞭芽成活率差異不顯著，污染率和死亡率出現(xiàn)顯著差異，污染率在次氯酸鈉處理時間為12 min時，達最高，為21.77%，死亡率在 17 min 時達到最高，為36.47%;當(dāng)乙醇處理 60 s 時，不同次氯酸鈉處理時間下鞭芽的污染率及死亡率均差異顯著，在消毒12 min時，成活率最高，為54.16%，消毒17 min時，污染率最低，僅為9.63%，但此時外植體的死亡率達最高，為47.77%。綜上所述，靚竹鞭芽消毒過程中，乙醇和次氯酸鈉處理時間不宜過長，最佳消毒處理組合為75%乙醇30 s+2%次氯酸鈉15 min。

2.2 不同季節(jié)采樣對靚竹無菌體系建立的影響

不同月份采集的靚竹鞭芽，外植體滅菌效果不同。從表4可以看出，2—7月外植體污染率較高，均在50%及以上，成活率較低，最低為23.41%;8—10月采集鞭芽，外植體死亡率較低，均在8%以下，成活率較其他月份高，最高成活率可達61.54%;1月與11—12月采集的外植體成活率無明顯差異，但該時期外植體死亡率、污染率較高，且該時期外植體萌動較慢，接種1周后開始出現(xiàn)萌動。觀察8—10月外植體成活率可知，8—9月成活率顯著高于10月，培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，8—9月外植體生長狀態(tài)較好，萌芽生長速度快，10月采集的外植體在轉(zhuǎn)瓶過程中易出現(xiàn)2次污染的現(xiàn)象，因此靚竹外植體最佳取樣季節(jié)為8—9月。

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對靚竹鞭芽誘導(dǎo)的影響

利用6-BA、KT、NAA 3種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)不同水平組合進行正交試驗（表5），3種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對鞭芽誘導(dǎo)的影響效果為6-BA>KT>NAA，6-BA、KT、NAA均對鞭芽誘導(dǎo)率產(chǎn)生顯著影響。對3種生長調(diào)節(jié)物質(zhì)不同水平對靚竹鞭芽誘導(dǎo)的影響結(jié)果進行多重比較，結(jié)果表明，6-BA最佳處理為水平2、水平3，而水平3處理下靚竹鞭芽的誘導(dǎo)率高于水平2處理，因此6-BA應(yīng)選擇水平3處理，即5 mg/L。KT最佳處理為水平2、水平3，但水平2處理下鞭芽的誘導(dǎo)率高于水平3處理，因此KT濃度應(yīng)選擇0.5 mg/L。NAA最佳處理為水平1、水平3，水平1處理下鞭芽的誘導(dǎo)率高于水平2，因此NAA的最適濃度為水平1，即不添加NAA。最適誘導(dǎo)組合為A3B2C1，且在該組合對應(yīng)的處理下，即處理8下，叢芽誘導(dǎo)率最高，為87.57%，與其他處理之間差異顯著，因此靚竹叢芽誘導(dǎo)最佳配方為 5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT。

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)對靚竹鞭芽叢芽增殖的影響

不同生長調(diào)節(jié)物質(zhì)組合對叢芽增殖過程中增殖系數(shù)及生長狀況均產(chǎn)生較大的影響。其中6-BA對叢芽增殖影響最大，其次為KT，最小的為TDZ。為明確6-BA及KT不同水平對叢芽增殖的影響，對6-BA、KT進行進一步多重比較，結(jié)果表明，6-BA最佳處理為水平1，平均增殖系數(shù)最高，為4.84，即6-BA最佳處理濃度為 3 mg/L。KT最佳處理為水平1，即KT最佳濃度為0.5 mg/L。通過對叢生芽生長情況的觀察，發(fā)現(xiàn)處理1與處理2、處理7之間差異不顯著，但處理7時，即6-BA濃度為 5 mg/L 時，叢生芽的平均生長高度、葉片平均長度及葉片數(shù)量均優(yōu)于其他配方下的叢生芽，且此時KT和TDZ均為最優(yōu)處理配方。增殖過程中，除了增殖系數(shù)指標(biāo)外，應(yīng)當(dāng)結(jié)合叢芽生長高度、生長狀態(tài)等各種指標(biāo)，共同比較從而篩選出最佳增殖配方。因此靚竹叢芽最佳增殖配方為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L TDZ（表6）。

2.5 生根培養(yǎng)

常規(guī)快繁體系建立過程中，需要獲取一定數(shù)量的叢芽之后，再對其進行生根誘導(dǎo)，從而建立其快繁體系。但本研究在對叢芽增殖過程中，組培苗出現(xiàn)不定根，對不同增殖配方下誘導(dǎo)出的不定根生長情況進行記錄（表7），在不含TDZ的培養(yǎng)基中未見不定根的出現(xiàn)，在TDZ為0.2、0.5 mg/L時，均可長出不定根。其中，處理2和處理5、處理9條件下組培苗生根率較低，不定根較短，數(shù)量較少;處理3條件下生根率增加，但叢芽生長較慢;在處理4條件下，生根率最高，達68.33%，平均根長6.32 cm，平均根數(shù)11.7條，但叢生芽生根后基部易發(fā)黑，增殖速度減慢（圖1-C）;處理7條件下生根率低于處理4，但該處理下叢生芽增殖系數(shù)高，生長速度快，未出現(xiàn)發(fā)黑現(xiàn)象，且該處理同時為叢芽增殖最佳培養(yǎng)基配方，因此靚竹生根過程中，最佳生根配方為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L TDZ。

2.6 移栽馴化

靚竹組培苗開蓋煉苗1周后，移栽至含有壤土與草炭土、蛭石不同組合的基質(zhì)中，進行培養(yǎng)觀察（表8）。不同基質(zhì)下靚竹移栽成活率均達到70%以上，其中在處理3條件下，即基質(zhì)配比為壤土 ∶草炭土=2 ∶1時移栽成活率最高，為95%，此時植株葉片完全展開，花葉逐漸增多，長勢較快;基質(zhì)全為壤土?xí)r，移栽成活率最低，為72%，不少葉片逐漸發(fā)黃， 基質(zhì)中添加蛭石比添加草炭土更適合靚竹組培

苗的生長。靚竹組培苗對光照的要求很高，在光照度較弱的地方，花葉易逐漸生長為綠葉，而隨著光照度的增加，新長出來的幼葉多為花葉。

3 結(jié)論與討論

建立無菌體系時，確定合適的消毒試劑及時間是成功進行組織培養(yǎng)的關(guān)鍵之一。正確的消毒方式可以有效抑制細(xì)菌、真菌等微生物的繁殖，有效防止外植體在培養(yǎng)過程中因染菌而死亡，從而提高其成活率[12]。乙醇、次氯酸鈉、氯化汞等是組培中常見的消毒試劑，其中氯化汞消毒效果最佳[13-14]，但氯化汞毒性大，易殘留，對環(huán)境易產(chǎn)生污染，且不易回收，被列為實驗室危險用品之一。不少研究表明，乙醇濃度為75%時[15-17]，消毒效果較好;次氯酸鈉溶液濃度為2%時[18-19]，滅菌效果最佳。因此本試驗選擇75%乙醇與2%次氯酸鈉溶液作為外植體的消毒試劑，對靚竹鞭芽進行消毒滅菌，結(jié)果表明，不同消毒劑處理不同時間對靚竹鞭芽的無菌率影響各不相同。靚竹鞭芽在乙醇處理時間為30 s時污染率較低，成活率較高，隨著乙醇消毒時間延長，盡管能夠?qū)⒔档臀廴韭?，但外植體卻因此受到傷害，造成死亡率上升、存活率降低。次氯酸鈉處理15 min時，鞭芽污染率較低;死亡率在不同乙醇處理條件下不同，在乙醇處理30 s時最低，此時成活率最高，因此靚竹最佳外植體滅菌處理為乙醇 30 s，2%次氯酸鈉溶液15 min，該處理下可獲得較多的無菌萌動外植體。

在組培過程中，污染的發(fā)生不僅與取材的位置有關(guān)，同時與取材的季節(jié)也有關(guān)系。不同季節(jié)采樣對靚竹鞭芽無菌體系的建立產(chǎn)生一定的影響，在春季及夏季采樣，外植體污染率較高，成活率較低，可能因為該時期休眠芽數(shù)量較多，在萌動過程中易造成染菌死亡。而在秋季采樣時，由于萌動芽數(shù)量多，不易經(jīng)消毒劑處理產(chǎn)生毒害作用而死亡，使得成活率較其他季節(jié)高。因此靚竹鞭芽最佳采集時間為8—9月，這與圣音竹[20]、花吊絲竹[21]取材時間存在較大差異，與吊絲球竹[22]取材時間相同。

植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)是影響組培快繁的重要因子之一，不同培養(yǎng)階段所需植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和濃度比例不同[23]。本研究中利用細(xì)胞分裂素與生長素對外植體進行叢芽的誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)靚竹鞭芽在只含有細(xì)胞分裂素6-BA與KT的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)效果最好，與云南龍竹、小蓬竹研究結(jié)果[24-25]相似，最佳靚竹鞭芽誘導(dǎo)配方為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT，誘導(dǎo)率可達87.57%，添加NAA不利于靚竹叢芽的誘導(dǎo)。繼代過程中經(jīng)常利用細(xì)胞分裂素進行叢生芽的增殖，不同細(xì)胞分裂素對不同植物叢生芽增殖的效果不同。陳宗禮等發(fā)現(xiàn)，TDZ與6-BA二者結(jié)合使用可顯著促進棗樹不定芽的增殖[26]。楊柳等在粉葛叢生芽增殖過程中發(fā)現(xiàn)6-BA和KT的組合可以讓繼代培養(yǎng)的苗長勢旺盛而健壯，更適合作為繼代培養(yǎng)的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[27]。在靚竹叢芽增殖過程中，最佳增殖配方為5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L KT+0.5 mg/L TDZ，增殖系數(shù)可達5.05，6-BA濃度高低在增殖過程中起主導(dǎo)作用，較高的濃度有利于靚竹叢芽的增殖，這與慈竹、云南甜龍竹的研究結(jié)果[28-29]相似。

植物根系發(fā)育調(diào)控的大量研究表明，激素是所有根系形成過程中必需的和共同的信號[30]。其中，生長素和細(xì)胞分裂素是2種最重要的生長調(diào)節(jié)物質(zhì)。通常認(rèn)為，細(xì)胞分裂素的主要生理功能之一是誘導(dǎo)芽的分化，而生長素則誘導(dǎo)根的分化。因此，在生根誘導(dǎo)過程中，經(jīng)常選擇生長素NAA/IBA等誘導(dǎo)不定根的形成，本研究中，在增殖過程中，培養(yǎng)基中只含有細(xì)胞分裂素時，出現(xiàn)生根苗，且試管苗增殖生長和生根均良好，這一現(xiàn)象在組織培養(yǎng)過程中較為罕見，這可能是由于在增殖培養(yǎng)過程中，植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度消耗導(dǎo)致培養(yǎng)基局部細(xì)胞分裂素濃度降低，從而使生長條件有利于根的形成[31]。王光萍等研究發(fā)現(xiàn)，只添加細(xì)胞分裂素可誘導(dǎo)竹子生根[32]。本研究中在不含TDZ的培養(yǎng)基中，未觀察到生根現(xiàn)象，而在添加少量的TDZ后，均出現(xiàn)不同程度的根系生長，表明TDZ可顯著誘導(dǎo)竹子生根，與Lin等研究結(jié)果[33]一致。此外，隨著靚竹組培苗在增殖培養(yǎng)基上繼續(xù)生長，不定根數(shù)量逐漸增多，根系變長，但叢生芽生長速度減慢，基部易出現(xiàn)發(fā)黑現(xiàn)象，說明不定根的生長會抑制竹子的增殖過程。

靚竹組培苗從無菌培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移到自然環(huán)境中，需要進行一定時間的煉苗處理，使其逐漸適應(yīng)外界自然環(huán)境。煉苗時間的長短是保障移栽后能否成活、正常生長發(fā)育的關(guān)鍵[34]。本研究中，靚竹組培苗經(jīng)過煉苗1周后，組培苗已逐漸適應(yīng)外界自然環(huán)境，將其移栽至不同基質(zhì)中，在壤土 ∶草炭土=2 ∶1基質(zhì)中，成活率最高，達95%，且幼苗生長較好，培養(yǎng)2個月后，植株開始出現(xiàn)較多的花葉，叢生芽在增殖過程中產(chǎn)生的生根苗，經(jīng)移栽后并成活，可對靚竹快繁體系的建立產(chǎn)生重要意義。

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