閆愛玲，王慧玲，孫 磊，張國軍，王曉玥，任建成，徐海英

（北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院，北京市落葉果樹工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，100093）

無核葡萄作為重要的鮮食和制干品種，深受人們的喜愛。目前無核葡萄品種是我國各葡萄產(chǎn)區(qū)的主推品種[1]，發(fā)展無核葡萄已成為當前鮮食葡萄生產(chǎn)的一種趨勢。因此越來越多的育種工作者參與到無核葡萄育種研究工作中[2-14]，無核胚挽救成為無核葡萄育種的主要方法之一?！瓵frodita’是引自保加利亞的種子敗育型葡萄品種，該品種平均單粒重6.5 g 左右，豐產(chǎn)，果皮黃綠色，果肉質(zhì)地中，可溶性固形物含量16%，果實成熟期8 月下旬，是果穗和果粒都較大的無核品種。但其缺點是口感淡，風(fēng)味不足，且殘核澀味比較明顯。我們想通過該品種與其他無核或香味品種雜交獲得口感更好的或有香味的無核后代，所以近2 年我們開展了該品種及其雜交胚的胚挽救研究工作，并對不同父本對‘Afrodita’雜交胚挽救的影響做了探討，也希望能為其他無核品種的胚挽救培養(yǎng)提供借鑒。

這些年，我們在無核葡萄胚挽救工作中積累了一些經(jīng)驗[3-4]，對于影響無核葡萄胚挽救育種效率的因素也有了更深入的了解[5-17]。在無核葡萄‘Kismis’的胚挽救技術(shù)研究中[4]，我們做了種子發(fā)育觀察試驗，得出了“從胚發(fā)育來看從心形胚到魚雷胚開始出現(xiàn)這個階段采樣最好”的結(jié)論。因此對于‘Afrodita’這個品種的胚挽救，根據(jù)胚的發(fā)育進程，我們的取樣時期從授粉后1個月起，到2個月結(jié)束，希望從中篩選出該品種最適宜的采樣期。根據(jù)多年經(jīng)驗及查閱文獻[4-11]，在培養(yǎng)基中添加了水解酪蛋白和活性炭作為基本成分之一，選取GA3、IAA 作為被篩選的植物生長調(diào)節(jié)劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2018 年4 月至2019 年12 月在北京市林業(yè)果樹科學(xué)研究院葡萄實驗地及實驗室進行。供試無核品種‘Afrodita’，無核、具香味品種‘愛神玫瑰’‘寒香蜜’‘無核翠寶’，無核、大粒品種‘瑞都無核怡’，品質(zhì)優(yōu)良的晚熟品種‘克瑞森無核’和具香味、早熟品種‘早玫瑰香’。所用的雜交組合為‘Afrodita’ב愛神玫瑰’、‘Afrodita’ב寒香蜜’、‘Afrodita’ב無核翠寶’、‘Afrodita’ב瑞都無核怡’、‘Afrodita’ב克瑞森無核’、‘Afrodita’ב早玫瑰香’及‘Afrodita’自然雜交。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間雜交

在始花期采集正常發(fā)育父本花序，收集花粉。于開花前1～3 d 對母本進行去雄，去雄后第2 d 進行授粉，連續(xù)授粉3 d。去雄后及每次授粉后立即套袋。每個組合雜交15 穗。

1.2.2 幼果采集和處理

將采下的幼果帶回實驗室，將果穗剪成4～5粒的小穗，放入燒杯中，用自來水沖洗1～2 h，再在超凈工作臺上，先用75%酒精漂洗1次，再用0.1%升汞消毒7～8 min，最后用無菌水漂洗3 次。用解剖刀取出胚珠接種在內(nèi)裝40 mL 培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，每瓶接種4～6 枚，放在培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.3 發(fā)育培養(yǎng)

（1）2018 年首次授粉30 d 后開始，每10 d 采摘1 次‘Afrodita’ב愛神玫瑰’、‘Afrodita’ב瑞都無核怡’、‘Afrodita’ב克瑞森無核’和‘Afrodita’自然雜交的雜交幼果，每次150 粒，共取4 次樣，接種在W1 培養(yǎng)基中。

（2）2019 年授粉50 d 后采集‘Afrodita’ב愛神玫瑰’、‘Afrodita’ב寒香蜜’、‘Afrodita’ב無核翠寶’、‘Afrodita’ב瑞都無核怡’、‘Afrodita’ב克瑞森無核’、‘Afrodita’ב早玫瑰香’、‘Afrodita’自然雜交的雜交果接種在以下4 種培養(yǎng)基中：W1 為改良MS＋500 mg/L 水解酪蛋白＋60 g/L 蔗糖＋6.5 g/L 瓊脂＋1.5 g/L 活性炭，W2 為NN＋500 mg/L 水解酪蛋白＋60 g/L 蔗糖＋6.5 g/L 瓊脂＋1.5 g/L 活性炭，W3 為改良MS＋0.5 mg/L GA3＋1.5 mg/L IAA＋500 mg/L 水解酪蛋白＋60 g/L蔗糖＋6.5 g/L 瓊脂＋1.5 g/L 活性炭，W4 為NN＋0.5 mg/L GA3＋1.5 mg/L IAA＋500 mg/L 水解酪蛋白＋60 g/L蔗糖＋6.5 g/L瓊脂＋1.5 g/L活性炭，25 ℃下，光照強度1 600 lx 培養(yǎng)。

1.2.4 胚萌發(fā)階段胚培養(yǎng)

胚發(fā)育培養(yǎng)60 d 后剝胚，剝胚時，統(tǒng)計胚發(fā)育情況。若解剖鏡下看到亮白色胚，視為胚發(fā)育；若所剝胚珠內(nèi)無亮白色胚（胚珠內(nèi)無胚或胚褐化），視為胚敗育。將發(fā)育的胚接種到胚萌發(fā)培養(yǎng)基1/2MS＋0.2 mg/L IBA＋20 g/L 蔗糖＋6.5 g/L 瓊脂＋1.0 g/L活性炭中繼續(xù)培養(yǎng)，pH 值5.8，25 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d 后調(diào)查胚萌發(fā)率。

對于（1）處理統(tǒng)計4 次取樣時期的幼胚發(fā)育率（W1，25 ℃）與萌發(fā)率，確定不同雜交組合最佳取樣時期。對于（2）處理比較各雜交組合在授粉后50 d 取樣雜交胚的胚發(fā)育率（W1～W4，25 ℃）和萌發(fā)率；胚發(fā)育培養(yǎng)60 d 后分別統(tǒng)計胚發(fā)育率，研究不同培養(yǎng)基對7個雜交組合胚發(fā)育率的影響。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)采用Excel 2003 進行處理，采用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析和差異比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 父本對取樣時期確定的影響

選取了父本為早熟的‘愛神玫瑰’、中熟的‘瑞都無核怡’及晚熟的‘克瑞森無核’3個組合和自然雜交的胚為試材，來確定最佳取樣時期。從表1可以看出，除了‘Afrodita’自然雜交，其他3個雜交組合‘Afrodita’ב愛神玫瑰’、‘Afrodita’ב瑞都無核怡’、‘Afrodita’ב克瑞森無核’均以授粉后50 d 取樣的胚發(fā)育率和萌發(fā)率最高，顯著高于其他取樣時期，胚發(fā)育率分別為27.52%、32.17%、9.30%，胚萌發(fā)率分別為12.84%、18.20%、5.81%。‘Afrodita’自然雜交50 d 和60 d 取樣的胚發(fā)育率和萌發(fā)率均差異不顯著，胚發(fā)育率分別為26.38%和 27.40%，胚萌發(fā)率分別為 15.95%和16.12%?？梢?，最佳取樣時期與母本的胚發(fā)育進程密切相關(guān)，與父本成熟的早晚無關(guān)。

表1 不同取樣時期離體胚珠生長發(fā)育情況

2.2 父本對幼胚生長發(fā)育的影響

從表2 可以看出，父本不同，雜交胚的發(fā)育和萌發(fā)率也不同。親本無核交有核的組合‘Afrodita’ב早玫瑰香’雜交胚的發(fā)育率和萌發(fā)率（38.70%、22.58%）均高于其他5個親本無核交無核的組合。父本有核有利于雜交胚的發(fā)育，但是卻降低了后代的無核率。在親本無核交無核的組合中，父本為‘無核翠寶’的胚發(fā)育率（34.72%）較高，顯著高于除‘Afrodita’ב瑞都無核怡’外的其他3個無核親本；胚萌發(fā)率18.05%，顯著高于其他4個無核親本。父本‘瑞都無核怡’的胚發(fā)育率（35.33%）較高，但萌發(fā)率（14.00%）卻不高?！瓵frodita’自然雜交的胚發(fā)育率（31.90%）顯著低于‘無核翠寶’和‘瑞都無核怡’作父本的，但胚萌發(fā)率（20.85%）卻比二者要高?！瓵frodita’ב克瑞森無核’雜交組合無論胚發(fā)育率還是萌發(fā)率都是最低的，分別為15.78%、7.89%。

表2 不同雜交組合幼胚生長發(fā)育情況

2.3 不同發(fā)育培養(yǎng)基對幼胚發(fā)育率的影響

從表3 可以看出，除了‘Afrodita’ב無核翠寶’和‘Afrodita’ב克瑞森無核’2個組合外，其他5個組合的胚發(fā)育率都是基本培養(yǎng)基為改良MS 的W1、W3 培養(yǎng)基較基本培養(yǎng)基為NN 的W2、W4 培養(yǎng)基高，其中‘Afrodita’ב瑞都無核怡’的雜交胚更適合生長在添加了植物生長調(diào)節(jié)劑的W3 培養(yǎng)基中，‘Afrodita’ב愛神玫瑰’、‘Afrodita’ב寒香蜜’、‘Afrodita’ב早玫瑰香’和‘Afrodita’自然雜交這4個組合胚發(fā)育率較高的都是W1 培養(yǎng)基?！瓵frodita’ב無核翠寶’組合的胚發(fā)育率是添加植物生長調(diào)節(jié)劑的W3、W4 培養(yǎng)基均顯著高于不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的W1、W2 培養(yǎng)基，該組合胚發(fā)育較合適的培養(yǎng)基是W3?！瓵frodita’ב克瑞森無核’組合的胚發(fā)育率是基本培養(yǎng)基為NN 的W2、W4 培養(yǎng)基均顯著高于基本培養(yǎng)基為改良MS的W1、W3 培養(yǎng)基，該組合胚發(fā)育較合適的培養(yǎng)基是W4。

表3 不同發(fā)育培養(yǎng)基胚珠發(fā)育情況

3 討論與結(jié)論

在胚挽救技術(shù)中，母本基因型和取樣時期對胚挽救效率的提高有關(guān)鍵作用。我們在最佳取樣時期試驗中選取了父本為早熟的‘愛神玫瑰’、中熟的‘瑞都無核怡’及晚熟的‘克瑞森無核’3個組合的雜交胚為試材，研究父本的成熟期對雜交胚發(fā)育時期的影響。結(jié)果表明，這3個雜交組合均在授粉后50 d 取樣的胚發(fā)育率和萌發(fā)率顯著高于其他取樣時期，說明父本的成熟期對雜交胚的生長發(fā)育無影響，最佳取樣時期與母本胚發(fā)育進程密切相關(guān)。這個結(jié)果再次驗證了我們在前些年的結(jié)論[3-4]，且同田淑芬等[2]、李志瑛等[10]、史文靜等[12]、屈田田等[13]的結(jié)論一致，同時也說明母本胚珠的發(fā)育程度是胚挽救取樣時期的關(guān)鍵[14-19]。

在父本對幼胚生長發(fā)育影響的試驗中選取了1個有核父本和5個無核父本，研究父本的有核或無核對雜交胚發(fā)育的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同父本的組合，雜交胚的發(fā)育和萌發(fā)率均不同，這也說明親本基因型是影響胚挽救結(jié)果的一個重要因素[12,20-25]，且不同父本胚挽救率不同[14]。父本有核的組合‘Afrodita’ב早玫瑰香’雜交胚的發(fā)育率和萌發(fā)率均高于其他5個無核的組合，這個結(jié)果與朱佩佩試驗中有核父本胚發(fā)育率與萌發(fā)率高于無核父本的結(jié)果是一致的[26]，說明父本的有核或無核能影響雜交胚的發(fā)育，且父本有核可能有助于提高雜交胚的坐果率，從而提高了雜交胚的發(fā)育率。馬麗等[27]認為有核品種作父本的果實內(nèi)可溶性糖、K、Mg 含量均高于無核品種作父本的果實，這說明可溶性糖、K、Mg 等可能有助于胚珠的生長發(fā)育，從而提高了胚挽救率。一般情況下無核葡萄的胚和胚乳的消失是受到基因嚴格調(diào)控的[28]，有核父本其胚和胚乳是不會消失的，也可能有利于雜交胚的發(fā)育。不同品種的基因型不一樣，種胚繼續(xù)發(fā)育和成苗能力也存在著顯著差異。不同父本雜交胚發(fā)育率和萌發(fā)率的差別也有可能與父本花粉活力及與母本的雜交親和力的差別有關(guān)[20,29]。

胚發(fā)育培養(yǎng)基為離體胚珠提供了幼胚發(fā)育所需的激素和營養(yǎng)物質(zhì)，直接影響到胚能否存活和進一步發(fā)育，因此胚發(fā)育培養(yǎng)基是胚挽救成功的關(guān)鍵因素之一。一般認為，胚發(fā)育的基本培養(yǎng)基使用Nitsch 或NN、MM3[20,30-31]較好，激素以赤霉素和生長素最為重要[9]，基本培養(yǎng)基中添加水解酪蛋白[11]和活性炭有助于胚發(fā)育和成苗。本試驗中‘Afrodita’ב瑞都無核怡’、‘Afrodita’ב寒香蜜’、‘Afrodita’ב愛神玫瑰’、‘Afrodita’ב早玫瑰香’4個組合和‘Afrodita’自然雜交適宜的基本培養(yǎng)基為改良MS，‘Afrodita’ב克瑞森無核’組合適宜的基本培養(yǎng)基為NN，‘Afrodita’ב無核翠寶’組合NN 培養(yǎng)基與改良MS 培養(yǎng)基差異不大。0.5 mg/L GA3＋1.5 mg/L IAA 可以提高‘Afrodita’ב無核翠寶’、‘Afrodita’ב瑞都無核怡’2個組合的雜交胚發(fā)育率，其他5個組合有可能基本培養(yǎng)基添加了水解酪蛋白和活性炭就能滿足雜交胚的發(fā)育，也有可能GA3和IAA 組合和濃度不適宜，需要進一步試驗確定。

本試驗研究表明，相同母本最適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基大體相同，不同父本對雜交幼胚的生長發(fā)育影響不同，所需植物生長調(diào)節(jié)劑的組合和濃度配比不同。以無核葡萄‘Afrodita’為母本的雜交后代培養(yǎng)技術(shù)及程序為：授粉后50 d取胚珠，在25 ℃下，改良MS＋500 mg/L 水解酪蛋白＋60 g/L 蔗糖＋6.5 g/L瓊脂＋1.5 g/L 活性炭為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加或不添加0.5 mg/L GA3＋1.5 mg/L IAA 的培養(yǎng)基上進行發(fā)育培養(yǎng)，剝胚后將胚轉(zhuǎn)移到1/2MS＋0.2 mg/L IBA＋20 g/L 蔗糖＋6.5 g/L 瓊脂＋1.0 g/L 活性炭的培養(yǎng)基上萌發(fā)生長。