陳 逃，郭 慧，袁 滿，譚福元，李益洲，李夢(mèng)龍

1. 四川大學(xué)化學(xué)學(xué)院，四川 成都 610064 2. 四川大學(xué)網(wǎng)絡(luò)空間安全學(xué)院，四川 成都 610064 3. 成都圖徑生物科技有限公司，四川 成都 610093

引 言

冬蟲夏草是菌絲體毛蟲和真菌性基質(zhì)芽的寄生復(fù)合物[1]，因?yàn)槠涑錾谋Ｗo(hù)和免疫調(diào)節(jié)作用，成為備受推崇的傳統(tǒng)中藥材。冬蟲夏草具有多種有效成分，包括多糖、蟲草、腺苷、甘露醇、固醇、甘露聚糖和核苷[1]等。各種分析方法已經(jīng)被應(yīng)用到冬蟲夏草活性成分的研究[2]。Li等[3]采用毛細(xì)管電泳測(cè)定冬蟲夏草三種主要核苷的含量來探究與藥理作用相關(guān)的成分。Yang等[4]優(yōu)化毛細(xì)管電泳質(zhì)譜法(CE-MS)同時(shí)測(cè)定天然蟲草和人工蟲草中的核苷和核苷堿基。Zhao等[5]結(jié)合親水相互作用色譜(HILIC)和電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)來表征和定量天然蟲草。Hu等[6]使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)在冬蟲夏草中檢測(cè)到有效的化學(xué)標(biāo)記。憑借指紋分析功能，近紅外光譜技術(shù)(NIR)也以其快速，低成本和無損檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，廣泛用于食品和藥物的定性和定量分析[7]。Xie等[8]使用傅里葉變換近紅外光譜(FT-NIR)定量測(cè)定冬蟲夏草菌絲體中精氨酸的含量，并通過特征選擇算法獲得了預(yù)測(cè)精氨酸含量的最佳波數(shù)。而紅外光譜在野生冬蟲夏草不同部位差異性研究鮮有報(bào)道。

紅外光譜信號(hào)通常會(huì)受到干擾，因此需要進(jìn)行預(yù)處理提高光譜數(shù)據(jù)質(zhì)量以便后續(xù)研究。標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變化(standard normal variation，SNV)[9]和多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)[10]已廣泛用于光譜數(shù)據(jù)的預(yù)處理。此外，通過變量選擇消除無關(guān)冗余信息，降低模型復(fù)雜度并提高模型穩(wěn)定性。

基于野生冬蟲夏草不同部位的紅外數(shù)據(jù)探討了采用不同預(yù)處理SNV和MSC、特征挑選競(jìng)爭(zhēng)自適應(yīng)再權(quán)重取樣(competitive adaptive reweighted sampling，CARS)[11]和變量組合種群分析(variable combination population analysis，VCPA)[12]、預(yù)測(cè)模型偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)[13]和線性判別分析(linear discriminant analysis，LDA)[14]分別構(gòu)建蟲草部位的識(shí)別模型，并比較各方法的效果和以及對(duì)篩選的特征波長(zhǎng)進(jìn)行分析，有助于在分子層面上加深對(duì)野生冬蟲夏草形成的認(rèn)識(shí)，可為后期藥物開發(fā)高效利用野生蟲草提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 數(shù)據(jù)源

用于實(shí)驗(yàn)的冬蟲夏草包括子座頭、子座中、頭部、蟲體中段、蟲體尾段總共808個(gè)樣本，均由成都圖徑生物科技有限公司提供，樣本詳細(xì)信息如表1所示。所有樣本采用美國(guó)PerkinElmer公司生產(chǎn)的Spectrum 100型傅里葉變換紅外光譜儀，掃描范圍為400～4 000 cm-1。訓(xùn)練集和測(cè)試集隨機(jī)按4∶1生成，訓(xùn)練集使用十倍交叉驗(yàn)證，準(zhǔn)確率(accuracy，Acc)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

表1 樣本信息Table 1 General information of samples

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理

紅外光譜在測(cè)量時(shí)，會(huì)受到背景噪聲和散射因素影響，因此對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理，可以提高后續(xù)光譜數(shù)據(jù)分析的可靠性。本研究使用標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)消除基線變化所引起的潛在影響、使用多元散射校正(MSC)消除散射效應(yīng)，增強(qiáng)紅外吸收光譜信息。

1.3 變量挑選

CARS[11]首先采用蒙特卡洛(Monte Carlo)策略將樣本數(shù)據(jù)集用于構(gòu)建PLS模型，基于模型的系數(shù)來估計(jì)波長(zhǎng)貢獻(xiàn)。然后采用指數(shù)遞減函數(shù)(exponentially decreasing function，EDF)除去系數(shù)絕對(duì)值小的波數(shù)。最后保留具有較大絕對(duì)值系數(shù)的波數(shù)作為特征選擇結(jié)果。

VCPA[12]也常用于光譜數(shù)據(jù)變量選擇。首先，使用二進(jìn)制矩陣采樣(binary matrix sampling，BMS)方法生成具有多樣性變量組合子集。其次采用模型總體分析(model population analysis，MPA)和訓(xùn)練集交互驗(yàn)證均方根誤差(root-mean squared error of cross-validation，RMSECV)評(píng)估子模型。然后根據(jù)指數(shù)遞減函數(shù)(EDF)去除PLS模型系數(shù)絕對(duì)值較小波長(zhǎng)。最后，具有最低RMSECV值的子集將作為最終變量選擇結(jié)果。

1.4 建模預(yù)測(cè)

LDA基本思想是在一定訓(xùn)練樣本上設(shè)法將樣本特征投影到子空間，使得同類樣本投影點(diǎn)互相聚集，不同類樣本投影點(diǎn)互相遠(yuǎn)離，這樣相同類別之間距離最小，對(duì)于新樣本進(jìn)行分類時(shí)，投影到同一子空間，根據(jù)投影位置和距離確定新樣本類別。

偏最小二乘判別分析(PLS-DA)是一種監(jiān)督分類方法，根據(jù)偏最小二乘回歸(PLSR)算法開發(fā)而來。PLS-DA算法集主成分分析、多元線性回歸和相關(guān)性分析等優(yōu)點(diǎn)于一身，可以將特征變量和目標(biāo)通過映射變換最終建立類別與光譜矩陣的判別關(guān)系。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同部位的紅外光譜比較

冬蟲夏草不同部位平均紅外光譜圖如圖1(a)所示，可看出部位間存在較大差異，但通過肉眼無法區(qū)分。冬蟲夏草不同部位間皮爾森相關(guān)系數(shù)計(jì)算如圖1(b)所示，可看出不同部位之間有很強(qiáng)的相關(guān)性，但不完全相同，因此借助化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行識(shí)別。

圖1 冬蟲夏草不同部位均值紅外光譜(a)與相似性(b)Fig.1 The averaged Fourier-transform infrared spectra for different parts of Cordyceps (a);The similarities between each two parts of Cordyceps (b)

2.2 不同部位的分類結(jié)果

表2可以看出，PLS-DA經(jīng)過CARS和VCPA特征挑選之后，特征維數(shù)大幅下降，分別從3 601降到669和420，而且準(zhǔn)確率90.1%，91.4%與全部特征預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率92.0%相當(dāng)。而LDA結(jié)果相對(duì)較差，模型最高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率為85.8%，經(jīng)特征挑選后準(zhǔn)確率分別為80.9%和82.1%。結(jié)果表明PLS-DA預(yù)測(cè)效果優(yōu)于LDA，特征挑選有利于降低模型復(fù)雜程度。

表2 不同部位的分類結(jié)果Table 2 The model performance on discriminating different cordyceps parts

針對(duì)不同特征挑選、建模方法所得獨(dú)立測(cè)試集預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)一步用混淆矩陣分析如圖2所示。結(jié)果表明，大多數(shù)錯(cuò)誤預(yù)測(cè)情況都出現(xiàn)在靠近對(duì)角線附近區(qū)域，表明該樣本被預(yù)測(cè)為臨近部位。

圖2 不同方法獨(dú)立測(cè)試集的混淆矩陣(a): CARS-PLS-DA; (b): CARS-LDA; (c): VCPA-PLS-DA; (d): VCPA-LDAFig.2 The confusion matrix of independent data set by different methods(a): CARS-PLS-DA; (b): CARS-LDA; (c): VCPA-PLS-DA; (d): VCPA-LDA

2.3 變量分析

對(duì)CARS和VCPA挑選的變量分析發(fā)現(xiàn)有85個(gè)共享特征，對(duì)于特征挑選結(jié)果差異性應(yīng)該來源于算法本身的差異。特征波數(shù)選擇結(jié)果對(duì)應(yīng)光譜圖中位置如圖3(a,b)所示。

圖3 CARS (a)和VCPA (b)特征選擇結(jié)果Fig.3 The result of feature selection method CARS (a) and VCPA (b)

其中共同波數(shù)參照文獻(xiàn)[15]報(bào)道見表3所示，如波數(shù)630與625 cm-1對(duì)應(yīng)冬蟲夏草活性成分甘露醇，說明特征挑選方法的特征波數(shù)具有一定化學(xué)意義，挑選特征具有可行性。

表3 蟲草特征挑選與化學(xué)解釋Table 3 Holistic assignment of infrared spectroscopy spectra of Cordyceps

對(duì)CARS和VCPA挑選波數(shù)畫出box-plot圖和Wilcoxon rank-sum檢驗(yàn)熱圖如圖4、圖5所示。從圖4當(dāng)中可看出，子座中段MS與蟲體中段ML的p值最低，該數(shù)據(jù)說明冬蟲夏草這兩部位活性成分差異性最顯著。如在圖4波數(shù)1 084 cm-1(b)所示，結(jié)果顯示在該波數(shù)下不同部位之間活性成分有顯著性差異。類似情況在圖5也可觀察得到。結(jié)果表明，冬蟲夏草不同部位之間活性成分有顯著性差異。

圖4 CARS選擇波數(shù)對(duì)應(yīng)箱線圖A(1 084, 1 024, 630, 879 cm-1)和Wilcoxon rank-sum檢驗(yàn)熱圖B(1 084, 1 024, 630, 879 cm-1)Fig.4 The box-plot A (1 084, 1 024, 630, 879 cm-1) and heat-map for Wilcoxon rank-sum test of wavenumbers selectedby CARS B(1 084, 1 024, 630, 879 cm-1)

圖5 VCPA選擇波數(shù)對(duì)應(yīng)箱線圖A(1 089，1 028，874，625 cm-1)和 Wilcoxon rank-sum檢驗(yàn)熱圖B(1 089，1 028，874，625 cm-1)Fig.5 The box-plot A(1 089，1 028，874，625 cm-1) and heat-map for Wilcoxon rank-sum test of wavenumbers selected by VCPA B(1 089，1 028，874，625 cm-1)

3 結(jié) 論

通過化學(xué)計(jì)量學(xué)模型結(jié)合紅外光譜數(shù)據(jù)，實(shí)現(xiàn)對(duì)野生冬蟲夏草不同部位有效識(shí)別?？傮w而言，PLS-DA模型優(yōu)于LDA模型，準(zhǔn)確率在90.0%以上，冬蟲夏草不同部位在活性成分上確實(shí)存在較大的差異。特征挑選方法可以保證準(zhǔn)確率的同時(shí)降低模型復(fù)雜程度，同時(shí)挑選的特征具有一定的化學(xué)可解釋性，說明特征挑選的可行性。本研究可有助于在分子水平上加深對(duì)野生冬蟲夏草形成的認(rèn)識(shí)，并對(duì)后期藥物開發(fā)高效利用蟲草提供參考，為合理有效利用名貴中草藥提供依據(jù)。