陳明哲 程云旺 魯康樂 張春曉 宋 凱 王 玲

(集美大學水產(chǎn)學院，廈門市飼料檢測與安全評價重點實驗室，廈門 361021)

牛蛙(Lithobatescatesbeianus)原產(chǎn)自北美洲，19世紀50年代引入中國，是一種具有較高經(jīng)濟價值的兩棲動物。因具有生長速度快、養(yǎng)殖成本低、肉味鮮美等特點，近年來，牛蛙養(yǎng)殖在我國中南部迅速發(fā)展，成為養(yǎng)殖產(chǎn)量最大的兩棲動物[1-2]。

蛋白質(zhì)是水生動物生長發(fā)育過程中的必需營養(yǎng)素。魚粉是牛蛙飼料的重要蛋白質(zhì)源，其蛋白質(zhì)含量高，氨基酸和脂肪酸平衡，消化率高[2]。然而，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，對飼用魚粉的需求不斷擴大，造成魚粉供不應求，價格不斷上升。因此，開發(fā)可替代魚粉的蛋白質(zhì)源成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要任務[3-5]。豆粕的蛋白質(zhì)豐富、來源廣泛，且價格穩(wěn)定，成為水產(chǎn)飼料中普遍使用的植物蛋白質(zhì)。但是，與魚粉相比，豆粕中存在植酸、皂苷、大豆抗原蛋白和胰蛋白酶抑制劑等抗營養(yǎng)因子，對養(yǎng)殖對象的生長性能和健康造成負面影響[6]。Kikuchi等[7]研究表明，用豆粕替代飼料中30%的魚粉后，紅鰭東方鲀的增重率(weight gain rate，WGR)和蛋白質(zhì)效率降低。此外，豆粕中存在的抗營養(yǎng)因子還會影響營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，誘發(fā)腸道功能障礙。如飼料中豆粕替代50%魚粉會誘發(fā)牛蛙腸炎，并降低其生長性能和飼料利用率[8]。因此，通過加工處理豆粕產(chǎn)品以提高飼料利用率對牛蛙飼料生產(chǎn)具有重要意義。

微生物發(fā)酵是一種經(jīng)濟有效的加工豆粕產(chǎn)品的技術。豆粕經(jīng)過發(fā)酵后，不僅能降解抗營養(yǎng)因子，將大分子蛋白質(zhì)分解為小肽，還能產(chǎn)生益生菌和益生元[9]。此外，通過發(fā)酵還能提高大豆生物活性肽的水平，對機體抗氧化、降低血脂和免疫調(diào)節(jié)具有促進作用[10]。目前，發(fā)酵豆粕已廣泛應用于養(yǎng)殖動物飼料中，并獲得很好的應用效果[11-13]。因此，本研究以牛蛙為試驗對象，探究發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙生長性能、腸道消化酶活性、血清生化指標及腸道組織結構的影響，為牛蛙配合飼料中發(fā)酵豆粕的利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

基礎飼料中含有20%魚粉，分別用發(fā)酵豆粕替代0、25%、50%、75%和100%的魚粉制作成5種等氮等能的試驗飼料(分別標記為FM、FSM25、FSM50、FSM75和FSM100)。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。按照飼料配方，將各種原料粉碎，過60目篩網(wǎng)后逐級混合，使用小型飼料膨化機制成直徑為2.5 mm的浮性顆粒飼料。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets (DM basis) %

3)營養(yǎng)水平均為實測值。Nutrient levels were measured values.

1.2 試驗設計和飼養(yǎng)管理

試驗牛蛙購自廈門市同安區(qū)一家牛蛙養(yǎng)殖場，蛙苗規(guī)格為25～30 g/只。養(yǎng)殖試驗在集美大學水產(chǎn)試驗場內(nèi)進行。試驗開始前，將牛蛙放入暫養(yǎng)缸中暫養(yǎng)12 d。暫養(yǎng)期間，每天用基礎飼料投喂2次(09:00和17:00)，并換水。暫養(yǎng)結束后，停喂24 h，挑選出體質(zhì)健康、規(guī)格均勻的牛蛙225只，試驗牛蛙初始體重為(36.0±1.0)g，隨機分為5組，每組3個重復(桶)，每個重復15只牛蛙。5組分別飼喂用發(fā)酵豆粕替代0(FM組)、25%(FSM25組)、50%(FSM50組)、75%(FSM75組)和100%(FSM100組)魚粉的試驗飼料。

試驗期間，每天飽食投喂2次(09:00、17:00)，每次喂食0.5 h后觀察攝食情況，記錄殘餌量，并換水。養(yǎng)殖期間水溫25～29 ℃。試驗期為56 d。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖56 d后，將牛蛙禁食24 h，對各養(yǎng)殖桶牛蛙計數(shù)和稱重。每個養(yǎng)殖桶隨機取6只牛蛙，用雙毀髓法處理，然后用1 mL的注射器抽取血液注入1.5 mL離心管中，靜置20 h，3 000 r/min離心10 min，分離取得血清，置于-80 ℃冰箱保存。將采完血的6只牛蛙解剖，取下后腿肌肉，置于-20 ℃冰箱保存，用于測定肌肉營養(yǎng)成分；取其中3只牛蛙的空腸分別放入裝有波恩氏液的凍存管中，置于4 ℃冰箱保存，用于制作腸道組織切片；分別取出另外3只牛蛙的十二指腸、空腸和回腸，放入凍存管中，置于-80 ℃冰箱保存，用于測定腸道消化酶活性。再從每個缸中隨機取出3只牛蛙裝入自封袋，置于-20 ℃冰箱保存，用于測定全體營養(yǎng)成分。

1.4 指標測定

1.4.1 常規(guī)成分

飼料原料、飼料、牛蛙全體和肌肉粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分和水分含量測定參考AOAC(2005)的方法進行。其中，水分含量采用105 ℃烘箱干燥恒重法測定，粗蛋白質(zhì)含量采用杜馬斯燃燒定氮法(Rapid N Ⅲ氮/蛋白質(zhì)分析儀)測定，粗脂肪含量采用索氏抽提法(乙醚為溶劑)測定，粗灰分含量采用馬弗爐550 ℃高溫灼燒法測定。

1.4.2 血清生化指標

血清超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷草轉氨酶(GOT)、谷丙轉氨酶(GPT)活性和丙二醛(MDA)含量均使用從南京建成生物工程研究所購買的試劑盒測定。

1.4.3 腸道消化酶活性

腸道淀粉酶活性使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。腸道蛋白酶活性采用福林-酚試劑法測定[14]，以標準L-酪氨酸濃度和吸光度值做標準曲線，用于計算蛋白酶活性。蛋白酶活性單位定義：每分鐘內(nèi)分解出1 μg酪氨酸的酶量為1個蛋白酶活性單位。

1.4.4 腸道組織結構

從波恩氏液中剪取0.3～0.4 cm的腸道組織，先用乙醇脫水，再用石蠟包埋，用切片機切片，切片厚度約6 μm，之后進行染色封片。完成腸道組織切片后，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 計算公式

增重率(%)=100×(Wt-W0)/W0；成活率(survival rate,SR,%)=100×Nf/Ni；攝食率(feeding rate,FR,%)=100×Wf/[t×(Wt+W0)/2]；飼料效率(feed efficiency,FE)=(Wt-W0)/Wf；氮保留率(nitrogen retention rate,NRR,%)=100×(Wt×Pt-W0×P0)/WP。

式中：Wt為終末牛蛙總重量(g)；W0為初始牛蛙總重量(g)；Nf為終末牛蛙數(shù)量；Ni為初始牛蛙數(shù)量；Wf為干物質(zhì)總攝食量(g)；t為飼喂天數(shù)(d)；Pt為終末全體蛋白質(zhì)含量(%)；P0為初始全體蛋白質(zhì)含量(%)；WP為攝入飼料蛋白質(zhì)總量(g)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及方差分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，并進行Duncan氏法多重比較，差異顯著水平為P<0.05。所有數(shù)據(jù)用平均值±標準誤表示。

2 結 果

2.1 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙生長性能的影響

由表2可知，各組牛蛙成活率均為100%。FM組牛蛙增重率顯著高于FSM100組(P<0.05)，但與其他各組差異不顯著(P>0.05)。FM組牛蛙攝食率、飼料效率和氮保留率與其他各組差異不顯著(P>0.05)。

表2 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙生長性能的影響Table 2 Effects of fish meal replacement by fermented soybean meal on growth performance of bullfrog

2.2 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙全體和肌肉營養(yǎng)成分的影響

由表3可知，各組之間牛蛙全體和肌肉的水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量沒有顯著差異(P>0.05)。FSM100組牛蛙肌肉粗灰分含量顯著低于FSM75組(P<0.05)。

表3 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙全體和肌肉營養(yǎng)成分的影響Table 3 Effects of fish meal replacement by fermented soybean meal on whole body and muscle nutritional composition of bullfrog %

2.3 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙腸道消化酶活性的影響

由表4可知，隨著飼料中發(fā)酵豆粕替代魚粉比例的增加，牛蛙十二指腸、空腸和回腸蛋白酶活性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，各替代組蛋白酶活性均顯著低于FM組(P<0.05)。各組之間牛蛙十二指腸淀粉酶活性無顯著差異(P>0.05)，F(xiàn)SM75組牛蛙空腸淀粉酶活性顯著高于FM組(P<0.05)，F(xiàn)SM50、FSM75和FSM100組牛蛙回腸淀粉酶活性顯著高于FM組(P<0.05)。

表4 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙腸道消化酶活性的影響Table 4 Effects of fish meal replacement by fermented soybean meal on intestinal digestive enzyme activities of bullfrog

2.4 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙血清生化指標的影響

由表5可知，F(xiàn)SM75組血清CAT活性顯著高于FM組(P<0.05)。FSM100組血清MDA含量顯著低于FM、FSM25和FSM50組(P<0.05)，與FSM75組差異不顯著(P>0.05)。FSM25組血清SOD活性顯著高于FM組(P<0.05)；從FSM25組到FSM100組，隨著飼料中發(fā)酵豆粕替代魚粉比例的增加，血清SOD活性呈下降趨勢。各組之間血清GOT活性差異不顯著(P>0.05)。從FSM25組到FSM100組，隨著飼料中發(fā)酵豆粕替代魚粉比例的增加，血清GPT活性呈上升趨勢；FM組血清GPT活性顯著高于FSM25組(P<0.05),與FSM50、FSM75和FSM100組差異不顯著(P>0.05)。

表5 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙血清生化指標的影響Table 5 Effects of fish meal replacement by fermented soybean meal on serum biochemical parameters of bullfrog

2.5 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙空腸組織結構的影響

通過顯微鏡觀察牛蛙空腸的組織切片，如圖1所示，當發(fā)酵豆粕替代50%魚粉時(FSM50組)，小腸絨毛固有層內(nèi)局部出現(xiàn)大量的嗜堿性顆粒。當發(fā)酵豆粕替代75%魚粉時(FSM75組)，小腸絨毛固有層出現(xiàn)大面積嗜堿性顆粒聚集，且腸絨毛變短。當發(fā)酵豆粕完全替代魚粉時(FSM100組)，小腸腸壁變薄，杯狀細胞數(shù)目減少，腸絨毛稀疏且較短，腸組織結構不完整。

3 討 論

3.1 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙生長性能的影響

已有研究表明，飼料中豆粕大量替代魚粉會降低養(yǎng)殖魚類的攝食率[15-16]。然而本試驗中，發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙的攝食率沒有顯著影響，這可能與牛蛙在自然狀態(tài)下為雜食性有關，也說明牛蛙對發(fā)酵豆粕有較好的適應性[17]。有研究表明，發(fā)酵豆粕可部分替代飼料中魚粉而不影響水生動物的生長。例如，發(fā)酵豆粕替代45%魚粉對大菱鲆生長無不良影響[18]，發(fā)酵豆粕替代20%魚粉不影響許氏平鲉的生長性能[19]。羅智等[20]通過折線回歸分析，得出飼料中發(fā)酵豆粕可替代10%魚粉而不影響石斑魚生長性能。Ding等[21]發(fā)現(xiàn)飼料中發(fā)酵豆粕100%替代魚粉對日本沼蝦的生長性能沒有顯著影響。Xu等[22]研究結果表明，2種發(fā)酵豆粕A和B分別可替代中華絨螯蟹飼料中10%和15%的魚粉，并具有一定的促生長作用。此外，在花鱸[23]、大黃魚[24]、異育銀鯽[25]、圓斑星鰈[26]中也有類似的報道。本試驗中，發(fā)酵豆粕替代100%魚粉組牛蛙增重率低于其他各組，表明發(fā)酵豆粕完全替代魚粉對牛蛙生長有一定抑制作用；而發(fā)酵豆粕替代75%魚粉時，牛蛙增重率無顯著下降，說明飼料中一定比例的魚粉或動物蛋白質(zhì)對牛蛙的生長有重要作用。研究表明，豆粕經(jīng)發(fā)酵處理后，大分子的蛋白質(zhì)分解為小肽、氨基酸，同時，抗營養(yǎng)因子含量大幅降低，更利于水產(chǎn)動物的消化吸收[20]。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵豆粕可以提高豆粕酸溶性、水溶性和小分子蛋白質(zhì)含量，從而提高豆粕的消化率和營養(yǎng)價值。此外，本試驗中補充了賴氨酸、蛋氨酸，平衡了飼料中的必需氨基酸，從而滿足發(fā)酵豆粕替代魚粉后牛蛙對氨基酸的需求。上述結果說明，發(fā)酵豆粕是牛蛙飼料的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)源。

FSM50和FSM75組圖中箭頭指向為小腸絨毛固有層局部大量嗜堿性顆粒聚集。FSM100組圖中箭頭指向為小腸腸壁變薄。The arrow in the figure of FSM50 and FSM75 groups indicate a large number of basophilic particles gathered locally in the lamina propria of intestinal villus.The arrow in the figure of FSM100 group indicate thinning of the intestinal wall of small intestine.圖1 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙空腸組織結構的影響Fig.1 Effects of fish meal replacement by fermented soybean meal on jejunum tissue structure of bullfrog

3.2 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙血清生化指標的影響

抗氧化系統(tǒng)包括酶促系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)，抗氧化酶包括SOD、CAT和谷胱甘肽過氧化物酶等，它們在組織中共同對抗自由基，形成第一道抗氧化防線[27]。SOD催化超氧陰離子經(jīng)過歧化作用變?yōu)檫^氧化氫和氧，CAT則分解過氧化氫成為水和氧[28]。MDA是脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，是生物體氧化損傷的重要標志物[29]。本研究中，隨著發(fā)酵豆粕替代水平的增加，牛蛙血清中MDA含量的總體變化趨勢與SOD相似，都呈下降趨勢，但血清CAT活性增加，說明發(fā)酵豆粕的添加可降低機體氧化水平，減少有害氧化產(chǎn)物的生成。分析其原因：一方面可能是魚粉中較高的脂肪含量，易于被氧化；另一方面可能是豆粕經(jīng)過發(fā)酵后增加了抗氧化產(chǎn)物水平。研究表明，發(fā)酵工藝能有效改善食品的營養(yǎng)價值和功能特性[30]。Lin等[31]研究發(fā)現(xiàn)，與商品豆粕相比，乳酸菌發(fā)酵豆粕減少了白蝦的氧化損傷。米曲霉發(fā)酵提高了豆粕中抗氧化化合物的生物利用度，進而提高了魚的抗氧化能力[32]。多酚類物質(zhì)是豆類中廣泛存在的天然抗氧化劑，研究表明，微生物發(fā)酵可提高一些豆科植物如鷹嘴豆[33]、菜豆[34]、兵豆[35]和大豆[36]等的抗氧化能力和總酚含量。GOT和GPT主要存在于肝細胞中，是機體氨基酸代謝過程中的2種關鍵酶，肝細胞受損時，GOT和GPT游離到血清中，因而血清中GOT和GPT活性可指示機體肝臟受損傷的程度[37]。本試驗中，發(fā)酵豆粕替代25%魚粉時牛蛙血清GOT和GPT活性均最低，可能說明飼料中添加部分發(fā)酵豆粕可以改善牛蛙的肝臟健康，這可能也是FSM25組中牛蛙生長性能提高的原因。

3.3 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙腸道消化酶活性的影響

蛋白酶和淀粉酶是水產(chǎn)動物腸道的2種主要消化酶，影響它們分泌的因素有很多，如攝食習慣、飼料組成和抗營養(yǎng)因子等[38-39]。本試驗中，發(fā)酵豆粕替代魚粉提高了牛蛙空腸和回腸的淀粉酶活性，這與本實驗室前期的研究結果[40]相似。這可能是飼料中碳水化合物含量的增加刺激了腸道淀粉酶活性的上升[41]，相似的結論也出現(xiàn)在對大菱鲆的研究中[42]。此外，本試驗中，隨著飼料中發(fā)酵豆粕替代魚粉比例的增加，牛蛙十二指腸、空腸和回腸蛋白酶活性呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，這可能是由于發(fā)酵豆粕中還存在大豆抗原蛋白、蛋白酶抑制因子等抗營養(yǎng)因子，抑制了蛋白酶的活性，類似的結果也出現(xiàn)在羅非魚[43]、大西洋鮭[44]、埃及胡子鲇[45]、花鱸[46]和黃金鯽[47]等的研究中。

3.4 發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙空腸組織結構的影響

腸道是消化和吸收的主要器官，其組織完整性關系到營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收和動物健康。本試驗中，隨著發(fā)酵豆粕替代比例的增加，牛蛙腸道絨毛出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，當發(fā)酵豆粕100%替代魚粉時，腸壁肌層厚度明顯降低，腸道完整性遭到破壞，表明高比例的發(fā)酵豆粕替代魚粉對牛蛙腸道結構造成影響，損傷腸黏膜，這與王健[40]的試驗結果一致。此外，在花鱸[46]和黃金鯽[47]的研究中也發(fā)現(xiàn)類似的結果。研究表明，豆粕對腸道組織的負面影響歸因于抗營養(yǎng)因子，如大豆抗原蛋白、皂苷、棉子糖、水蘇糖和植物凝集素等[48-50]。Buttle等[51]報道，凝集素與腸道上皮細胞表面的多糖結合可破壞腸道微絨毛，導致營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和消化減少。Hu等[52]研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮和大豆皂苷破壞黃鱔腸道結構和腸道屏障，引起腸道炎癥。Zhang等[53]研究發(fā)現(xiàn)，大豆球蛋白引起草魚腸上皮細胞核移位和杯狀細胞充血。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，豆粕替代50%魚粉后，牛蛙空腸絨毛高度、肌層厚度和柱狀上皮高度顯著降低[8]。本試驗中，發(fā)酵豆粕替代魚粉水平在50%以下時，沒有對牛蛙腸道造成明顯負面影響，說明發(fā)酵處理可能在一定程度上減少了豆粕中抗營養(yǎng)因子或產(chǎn)生了有益的微生物代謝產(chǎn)物，改善了牛蛙腸道健康。

4 結 論

本試驗條件下，飼料中發(fā)酵豆粕替代75%魚粉不會影響牛蛙生長性能、氮保留率和飼料效率，但對牛蛙腸道組織結構造成一定的負面影響。建議牛蛙飼料中發(fā)酵豆粕替代魚粉的比例為50%～75%。