梁源 邵建民 楊旭 楊文超 萬兵

(1漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河 462002；2漯河市中心醫(yī)院)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)起病隱匿、惡性程度高，具有生存率低、病死率高等特點(diǎn)〔1〕。目前，伴隨生活條件的改善、壽命的增長及環(huán)境污染等因素的改變，OSCC的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)明顯的上升趨勢(shì)，發(fā)病年齡亦趨向年輕化〔2〕。目前該病主要采用手術(shù)、放療、化療及中醫(yī)等療法，雖已取得較大進(jìn)展，但治療后的復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率依然較高〔3〕。因此，尋找低毒性、高選擇性的抗OSCC藥物，是目前急需解決的課題。石蒜堿為一種異喹啉類生物堿，主要從石蒜鱗莖分離純化出來，具有良好的抗病毒、抗炎、抗腫瘤活性〔4〕。然而石蒜堿對(duì)OSCC的影響鮮有報(bào)道?；罨牡鞍准っ窩1受體(RACK1)為一種支架蛋白，其在多種腫瘤中均有表達(dá)，并呈現(xiàn)明顯的高表達(dá)。研究〔5〕發(fā)現(xiàn)，RACK1低表達(dá)顯著抑制OSCC細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但目前關(guān)于RACK1與石蒜堿誘導(dǎo)的OSCC細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控關(guān)系還不太明確。因此，本研究針對(duì)石蒜堿抗OSCC作用與RACK1的關(guān)系進(jìn)行了研究，為OSCC研究提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 人OSCC CAL-27細(xì)胞株購自上?；鄯f生物科技有限公司。石蒜堿購自南京景竹生物科技有限公司，高效液相色譜(HPLC)≥98%，含0.1%DMSO的DMEM配置成不同濃度；兔抗人Ki67、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)x蛋白(Bax)、RACK1抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自美國，Sigma公司；RACK1 Human siRNA購自O(shè)rigene公司，美國。倒置熒光顯微鏡購自Nikon Corp；酶標(biāo)儀購自美國，BioTek。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) CAL-27細(xì)胞株接種到含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2細(xì)胞活力檢測 取對(duì)數(shù)期密度為1×104個(gè)/ml CAL-27細(xì)胞株接種于96孔板，100 μl/孔，24 h貼壁后棄上清。加入含有石蒜堿的DMEM 100 μl，石蒜堿終濃度分別為0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 μmol/L，對(duì)照組只加等量的培養(yǎng)基。每孔重復(fù)3次。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入CCK-8 10 μl，培養(yǎng)2 h，于450 nm測定光密度值(A)，計(jì)算細(xì)胞活力。抑制率(%)=1-(A給藥-A空白)/(A對(duì)照-A空白)×100。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 5.00、2.50、1.25 μmol/L石蒜堿作用于對(duì)數(shù)期CAL-27細(xì)胞株48 h后，胰酶消化，1 200 r/min，離心半徑17.39 cm，離心5 min，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。 取5萬重懸的細(xì)胞，1 200 r/min，離心半徑17.39 cm，離心5 min，棄上清，加入195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加5 μl Annexin V-FITC，10 μl PI，混勻，培養(yǎng)15 min，立即進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。

1.2.4Western印跡 總蛋白常規(guī)提取，二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度。20 μl蛋白樣品加樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%山羊血清封閉1 h，加入一抗(Ki67、 PCNA、Bcl-2、Bax、RACK1和β-actin的稀釋比例分別為1∶2 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶2 000、1∶2 000和1∶1 000)，4℃孵育過夜，HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，凝膠成像系統(tǒng)成像，并進(jìn)行灰度分析。

1.2.5敲低RACK1的表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞株增殖的影響 細(xì)胞分組：對(duì)照組、石蒜堿組、石蒜堿+RACK1 siRNA組。其中石蒜堿干預(yù)濃度為2.50 μmol/L，依據(jù)分組計(jì)劃，RACK1 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后，加入石蒜堿繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后，采用CCK-8法檢測細(xì)胞活力，方法同1.2.2。

1.2.6敲低RACKl的表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞株凋亡的影響 參照1.2.5分組，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，方法同1.2.3。 Western印跡檢測Bcl-2、Bax水平，方法同1.2.4。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行方差分析、LSD-t法。

2 結(jié) 果

2.1石蒜堿對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CAL-27細(xì)胞抑制率組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F組間=7.408，P<0.05)；同時(shí)抑制率隨著時(shí)間延長，呈增長趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F時(shí)間=91.276，P<0.05)；并且處理因素與時(shí)間有交互作用(F交互=9.438，P<0.05)。其中48 h時(shí)石蒜堿對(duì)CAL-27細(xì)胞IC50為7.635 μmol/L。而0.1%的DMSO 48 h時(shí)的抑制率為(4.73±0.05)%。見表1。同時(shí)，石蒜堿處理48 h后，與對(duì)照組比較，1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L的石蒜堿能顯著降低增殖蛋白Ki67、PCNA水平(P<0.05)。見圖1，表2。

表1 石蒜堿對(duì)CAL-27細(xì)胞增殖的影響

1～4：對(duì)照組、石蒜堿1.25 μmol/L組、石蒜堿2.50 μmol/L組、石蒜堿5.00 μmol/L組；圖3、4同圖1 石蒜堿對(duì)增殖標(biāo)記蛋白的影響

表2 石蒜堿對(duì)增殖標(biāo)記蛋白的影響

2.2石蒜堿對(duì)CAL-27細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(3.5±0.4)%，1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L的石蒜堿處理后凋亡率分別為(12.4±1.2)%、(20.4±1.3)%、(30.6±1.4)%。與對(duì)照組比較，1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L的石蒜堿處理后細(xì)胞凋亡率增加明顯(P<0.05)。見圖2。同時(shí)，與對(duì)照組比較，不同濃度的石蒜堿能明顯提高CAL-27細(xì)胞Bax的蛋白水平，降低Bcl-2的蛋白水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3、圖3。

圖2 石蒜堿對(duì)CAL-27細(xì)胞凋亡的影響

表3 石蒜堿對(duì)凋亡蛋白的影響

圖3 Western印跡檢測凋亡蛋白的表達(dá)

2.3石蒜堿對(duì)RACK1蛋白的影響 對(duì)照組RACK1表達(dá)水平為(0.85±0.03)，1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L的石蒜堿處理后RACK1表達(dá)水平分別為(0.64±0.05)、(0.21±0.03)、(0.12±0.02)。與對(duì)照組比較，1.25 μmol/L、2.50 μmol/L、5.00 μmol/L石蒜堿處理后RACK1表達(dá)水平均明顯下降(均P<0.05)。見圖4。

圖4 Western印跡檢測RACK1蛋白的表達(dá)

2.4敲低RACKl的表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞株增殖的影響 與對(duì)照組比較，石蒜堿組和石蒜堿+RACK1 siRNA組增殖率明顯增加(P<0.05)；與石蒜堿組比較，石蒜堿+RACK1 siRNA組增殖率明顯增加(P<0.05)。見表4。

2.5敲低RACKl的表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞株凋亡的影響 與對(duì)照組比較，石蒜堿組和石蒜堿+RACK1 siRNA組凋亡率明顯增加(P<0.05)；與石蒜堿組比較，石蒜堿+RACK1 siRNA組凋亡率明顯增加(P<0.05)。見圖5。與對(duì)照組比較，石蒜堿組和石蒜堿+RACK1 siRNA組明顯提高CAL-27細(xì)胞Bax蛋白水平，降低Bcl-2蛋白水平(P<0.05)；與石蒜堿組比較，石蒜堿+RACK1 siRNA組Bax蛋白水平明顯增加，Bcl-2蛋白水平明顯降低(P<0.05)。見表4、圖6。

表4 敲低RACKl對(duì)石蒜堿調(diào)控增殖、凋亡的影響

圖5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

1～3：對(duì)照組、石蒜堿組、石蒜堿+RACK1 siRNA組圖6 敲低RACK1的表達(dá)對(duì)CAL-27細(xì)胞株凋亡蛋白的影響

3 討 論

石蒜堿為來源于石蒜鱗莖的異喹啉類生物堿，藥理研究〔6〕顯示，石蒜堿具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡作用。研究表明，石蒜堿能抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞自噬〔7〕，誘導(dǎo)肺癌NCI-H460細(xì)胞凋亡作用〔8〕。但對(duì)OSCC細(xì)胞的抗腫瘤效果鮮有報(bào)道，本研究通過給藥OSCC CAL-27細(xì)胞進(jìn)行體外抗腫瘤研究，結(jié)果提示石蒜堿能通過下調(diào)Ki67和PCNA水平抑制OSCC CAL-27增殖；石蒜堿可誘導(dǎo)OSCC CAL-27細(xì)胞凋亡。Bcl-2為抗凋亡基因，而Bax為典型的促凋亡基因。提示石蒜堿能通過調(diào)控經(jīng)典的Bcl-2/Bax信號(hào)通路啟動(dòng)線粒體凋亡，誘導(dǎo)OSCC CAL-27凋亡。石蒜堿調(diào)控癌細(xì)胞增殖與多種細(xì)胞機(jī)制有關(guān)，如調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞自噬達(dá)到細(xì)胞凋亡的目的〔7〕。也有研究顯示，石蒜堿調(diào)控細(xì)胞增殖和凋亡與MAPK、Akt/smad信號(hào)通路密切相關(guān)〔9〕。文獻(xiàn)顯示，RACK1為MAPK、Akt信號(hào)通路上游的信號(hào)分子，下調(diào)RACK1的表達(dá)，可抑制Src/Akt 信號(hào)通路活性，抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲〔10〕。RACK1 為支架蛋白，通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成等影響癌細(xì)胞的進(jìn)展。而且RACK1下調(diào)還與肺腺癌化療的敏感性增加有關(guān)〔11〕。本研究結(jié)果說明石蒜堿抑制OSCC CAL-27細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與調(diào)控RACK1 表達(dá)水平有關(guān)。而且通過進(jìn)一步研究顯示，采用siRNA下調(diào)RACK1 表達(dá)的表達(dá)水平后，石蒜堿抑制OSCC CAL-27細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用明顯增強(qiáng)，這也進(jìn)一步證明石蒜堿調(diào)控OSCC CAL-27細(xì)胞增殖和凋亡的與調(diào)控RACK1表達(dá)水平有關(guān)。

總之，石蒜堿能通過調(diào)控RACK1的表達(dá)水平調(diào)控OSCC CAL-27增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，可以為口腔鱗癌的治療提供新的靶點(diǎn)，同時(shí)也為石蒜堿的開發(fā)提供新的依據(jù)。