孫夢奎，李守林

(深圳市兒童醫(yī)院 泌尿外科，廣東 深圳 518038)

腎臟纖維化(renal fibrosis)包括腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質纖維化及細胞外基質異常分布等，是各類腎臟疾病、損傷進展到終末期時的主要病理改變之一。探索如何延緩甚至逆轉腎臟纖維化從而更好的保護腎臟功能一直是研究的熱點。綠原酸(chlorgenic acid，CGA)是由咖啡酸和奎寧酸聚合所形成的酯酸，是植物經(jīng)有氧呼吸過程產(chǎn)生的苯丙素類化合物。有報道稱其能夠有效的緩解肺[1]、肝臟[2]等器官的纖維化。但是，其對腎臟纖維化是否有影響卻暫無相關報道。腎臟纖維化的一個顯著特點就是腎小管上皮細胞表達膠原纖維蛋白Ⅰ和Ⅲ增加。本研究擬探索CGA對人腎小管上皮HK-2細胞表達纖維化因子的影響及其潛在分子機制，為臨床上治療腎臟纖維化提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小管上皮細胞系HK-2(ATCC公司)；細胞培養(yǎng)基DMEM/F-12(Hyclone公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)；綠原酸(Sigma-Aldrich公司)；重組人TGF-β1(PeproTech公司)；TRIzol試劑(Invitrogen公司)；RNA反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)；目的基因上下游引物(上海生工生物工程有限公司)；TLR4(Toll-like receptor 4/nuclear factor κB)、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB及GAPDH抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及分組:于含10%胎牛血清、青霉素 100 IU/mL和鏈霉素 100 IU/mL的DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)人腎小管上皮HK-2細胞，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2細胞孵育箱中。CGA對HK-2細胞增殖的影響中，細胞分組為0、20、40、80 μg/mL的CGA分別處理細胞0、12、24、36、72 h，共20組。后續(xù)實驗分組：對照組(磷酸鹽緩沖液處理48 h)，TGF-β1組(5 ng/mL人重組TGF-β1處理48 h)。CGA組(20、40、80 μg/mL的CGA處理48 h)。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖:將處于對數(shù)增殖期的HK-2細胞混懸液以2×104個/mL接種于96孔板，每孔100 μL。靜置24 h待細胞貼壁后，用100 μL的細胞培養(yǎng)基DMEM/F-12與10 μL的CCK-8試劑混勻，加入各孔之中并與細胞孵育1 h，在激發(fā)波長設為450 nm的酶標儀下測定各孔吸光度值(absorbance value，A)。

1.2.3 Real-time PCR檢測mRNA表達:收集各組HK-2細胞，添加Trizol細胞裂解液1 mL提取總RAN。用分光光度計檢測RNA吸光度值。波長在260 nm的吸光值/280 nm的吸光度值(A260/A280)位于1.8～2.1為合格樣本，可用于后續(xù)實驗。根據(jù)RNA反轉錄試劑盒說明書，用20 μL反應體系進行反轉錄，獲得模板cDNA。采用20 μL反應體系以上述cDNA為模板進行擴增。其中cDNA為4 μL，上、下游引物分別為1 μL，SYBR混合物10 μL，超純水4 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共計30個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。上下游目的基因引物。Collagen Ⅰ上游序列5′-GCCAAGACGAAGACATCCCA-3′，下游序列5′-CACCATCATTTCCACGAGCA-3′；collagen Ⅲ上游序列5′-GAGCTGGCTACTTCTCGCTC-3′，下游序列5′-CCTTGACCATTAGGAGGGCG-3′；E-cadherin上游序列5′-GGGGTCTGTCATGGAAGGTG-3′，下游序列5′-CAAAATCCAAGCCCGTGGTG-3′；α-SMA 上游序列5′-AAAGCAAGTCCTCCAGCGTT-3′，下游序列5′-TTAGTCCCGGGGATAGGCAA-3′；vimentin上游序列5′-CCGCACATTCGAGCAAAGAC-3′，下游序列5′-AAGCGCACCTTGTCGATGTA-3′；TGF-β1上游序列5′-ATGGTGGAAACCCACAACGA-3′,下游序列5′-ATGACACAGAGATCCGCAGTC-3′；snail上游序列5′-CGAGTGGTTCTTCTGCGCTA-3′,下游序列5′-GG GCTGCTGGAAGGTAAACT-3′；slug上游序列5′-AC GCCTCCAAAAAGCCAAAC-3′,下游序列5′-ACTC ACTCGCCCCAAAGATG-3′；GAPDH上游序列5′-TT GCAACCGGGAAGGAAATG-3′，下游序列5′-TGGA ATTTGCCATGGGTGGA-3′。

1.2.4 免疫熒光檢測細胞膠原纖維的表達:將處于對數(shù)增殖期的HK-2細胞混懸液以2×104個/mL接種于6孔板爬片。4%多聚甲醛固定10 min，0.5%的Triton X-100透膜10 min，向玻片滴加山羊血清封閉30 min,然后滴加一抗孵育過夜。Collagen Ⅰ和collagen Ⅲ的濃度均為1∶50。向玻片上滴加熒光二抗，濕盒中避光孵育1 h。滴加DAPI避光孵育5 min，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，紅色熒光為陽性表達。每張切片隨機取5個視野，采用Image Pro Plus 6.0圖像處理分析軟件計算高倍鏡視野下熒光密度值。

1.2.5 Western blot檢測目的蛋白表達:添加RIPA裂解HK-2細胞并提取總蛋白，使用BCA法進行蛋白定量。制備SDS/PAGE凝膠，各孔加入20 μL蛋白樣。電泳分離蛋白，電轉蛋白至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入抗體TLR4(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)及GAPDH(1∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，5 min/次。添加二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，5 min/次。采用ECL化學發(fā)光和曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 不同濃度的綠原酸(CGA)對HK-2細胞增殖的影響

各濃度(0、20、40、80 μg/mL)綠原酸組細胞增殖之間無顯著差異(表1)。

表1 CGA對HK-2細胞增殖的影響Table 1 Effect of chlorogenic acid on proliferation of HK-2 cells

2.2 CGA對TGF-β1誘導的HK-2細胞表達纖維化相關基因及蛋白的影響

與對照組相比，TGF-β1組collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、α-SMA、vimentin、TGF-β1、snail及slug 表達增加，而E-cadherin 表達降低(P<0.01)。與TGF-β1組相比，不同濃度的CGA能夠降低collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、α-SMA、vimentin、TGF-β1、snail及slug表達，而增加E-cadherin 表達(P<0.01)(圖1～2，表2～4)。

表2 CGA對HK-2 細胞collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、E-cadherin及α-SMA mRNA表達的影響Table 2 Effect of chlorogenic acid on collagen Ⅰ,collagen Ⅲ,E-cadherin and α-SMA expression of HK-2 cells in mRNA level

表3 CGA對HK-2 細胞vimentin、TGF-β1、snail及slug mRNA表達的影響Table 3 Effect of chlorogenic acid on vimentin,TGF-β1,snail and slug mRNA expression of HK-2 cells in mRNA level

表4 CGA對HK-2 細胞collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表達的影響Table 4 Effect of chlorogenic acid on collagen Ⅰ and collagen Ⅲ expression of HK-2 cells

圖1 CGA對HK-2細胞collagen Ⅰ表達的影響Fig 1 Effect of chlorogenic acid on collagen Ⅰ expression of HK-2 cells

圖2 CGA對HK-2細胞collagen Ⅲ表達的影響Fig 2 Effect of chlorogenic acid on collagen Ⅲ expression of HK-2 cells

2.3 CGA對TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

與對照組相比，TGF-β1組TLR4、p-IκBα及p-NF-κB蛋白表達量增加(P<0.01)。與TGF-β1組相比，綠原酸(80 μg/mL)組的HK-2細胞TLR4、p-IκBα及p-NF-κB蛋白表達量明顯降低(P<0.01)(圖3，表5)。

表5 CGA對TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響Table 5 The effect of chlorogenic acid on expression of TLR4/NF-κB signal pathway related protein

圖3 CGA對TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響Fig 3 Effect of chlorogenic acid on expression of TLR4/NF-κB signal pathway related protein

3 討論

腎臟纖維化是所有慢性腎病或損傷如慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病等發(fā)展至終末期腎病的共同病理改變。截至目前，腎臟纖維化的機制尚未完全明了。尋找有效的抗腎臟纖維化手段是目前的研究熱點。

CGA廣泛分布于各類植物中，多項研究表明，CGA具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]的功能。除此之外，研究表明CGA能夠有效的抑制肝臟纖維化，其具體機制與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad7信號通路[2]、抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路均有關系[5]。但是，CGA是否能夠抑制腎小管纖維化卻并無報道。

TGF-β1誘導HK-2細胞分泌纖維化因子是常用的腎臟纖維化細胞模型[6]。Collagen Ⅰ和collagen Ⅲ是腎間質重要的細胞基質成分，隨著腎臟纖維化的進展，含量會顯著增加[7]。細胞外基質出現(xiàn)異常積聚是腎臟纖維化特征性的表現(xiàn)之一，部分源自于腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞的合成和分泌[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1預處理后的人腎小管上皮HK-2細胞collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表達增加，綠原酸處理HK-2細胞，能夠降低collagen Ⅰ和collagen Ⅲ的表達，減少細胞外基質的產(chǎn)生，抑制腎臟纖維化。

研究表明，腎臟纖維化時腎小管細胞能夠向間質細胞分化，轉變?yōu)槌衫w維細胞，成為細胞外基質的一個重要來源[9]。上皮細胞向間質細胞轉化表現(xiàn)為細胞黏附分子E-cadherin表達降低，α-SMA表達增加，細胞骨架發(fā)生變化，vimentin表達增加，snail、slug表達增加[10-11]。本研究中，CGA能夠有效的抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞上皮間質化，從而抑制腎小管上皮纖維化。

有研究證實TLR4/NF-κB信號通路參與腎臟纖維化[12]。臍帶來源的間充質干細胞的條件培養(yǎng)基能夠抑制TLR4/NF-κB信號通路，從而保護大鼠部分輸尿管梗阻導致的腎小管上皮的纖維化[13]。所以抑制TLR4/NF-κB信號通路，能夠有效的保護腎小管上皮細胞，減少細胞纖維化。同時，大量研究表明，CGA能夠有效的抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活[5]。本研究證實，CGA能有效的抑制TLR4/NF-κB信號通路。

綜上所述，CGA能夠有效的抑制TGF-β1誘導的人腎小管上皮HK-2細胞分泌纖維化因子，其分子機制與抑制TLR4/NF-κB信號通路激活有關。