姜 驪，李建輝，俞 浩，李浩宇，謝海洋，周 琳，鄭樹(shù)森,*

(1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，浙江 杭州 310003；2.衛(wèi)健委多器官聯(lián)合移植研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310003；3.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院 肝膽胰外科，浙江 杭州 310003)

肝移植是治療終末期肝病的唯一有效方法。在中國(guó)，終末期肝病患者大約有800萬(wàn)人。截至2018年末，中國(guó)器官分配與共享計(jì)算機(jī)系統(tǒng)(COTRS)中等候肝移植的患者尚有3 841名[1]。

心臟死亡器官捐獻(xiàn)(donation after cardiac death,DCD)供肝及擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)的邊緣供肝應(yīng)用可一定程度緩解供肝短缺，但也對(duì)器官修復(fù)提出了更高的要求[2]。機(jī)械灌注技術(shù)作為靜態(tài)冷保存技術(shù)(static cold storage，SCS)的可能替代技術(shù)，越來(lái)越多研究結(jié)果證明其有較好的器官保護(hù)修復(fù)潛力[3]。同時(shí)機(jī)械灌注也成為了各種器官保護(hù)治療藥物的應(yīng)用平臺(tái)。通過(guò)向灌流液中加入藥物、siRNA及干細(xì)胞等促進(jìn)器官的保存修復(fù)已成為器官保護(hù)的一個(gè)重要研究方向[4]。FK506是臨床常用的強(qiáng)力新型免疫抑制劑，在肝腎移植領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。同時(shí)可用于供肝移植前沖洗，減少肝臟缺血再灌注損傷的發(fā)生，促進(jìn)肝臟恢復(fù)，但具體效果仍需探究。

因此本研究在前期機(jī)械灌注研究基礎(chǔ)上[5]，依托自研小動(dòng)物多器官灌注系統(tǒng)PU-100設(shè)備，將FK506作為灌流液組分加入HTK液(Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate solution)中進(jìn)行機(jī)械灌注，探索FK506聯(lián)合低溫機(jī)械灌注對(duì)供肝的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：24只8周齡雄性SPF級(jí)SD大鼠[杭州醫(yī)學(xué)院SCXK(浙)2019-0002]。飼于浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(浙)2019-0012]。

1.1.2 主要試劑：HTK液(Dr.Franz Kohler化學(xué)有限公司)、FK506(中美華東制藥有限公司)、戊巴比妥鈉(成都貝斯特試劑有限公司)、肝素(信康醫(yī)藥化工有限公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS)(Sigma Aldrich 公司)，ALT、AST、LDH試劑(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分組及處理：大鼠肝臟的獲取按照本團(tuán)隊(duì)先前研究操作，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。灌注平臺(tái)基于小動(dòng)物多器官灌注系統(tǒng)PU-100(中國(guó) Lifeperfusor)進(jìn)行搭建。供肝修整完畢后，將門(mén)靜脈與小動(dòng)物多器官灌注系統(tǒng)PU-100灌注平臺(tái)連接，進(jìn)行灌注。灌注期間參數(shù)設(shè)定如下：門(mén)靜脈流量1.2 mL/min；溫度4 ℃；灌注時(shí)間3 h。HTK組灌注液為150 mL HTK，F(xiàn)K506+HTK組為150 mL FK506(20 ng/mL)+ HTK液。大鼠肝臟經(jīng)體外灌注后，進(jìn)行肝移植，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[6]。灌注期間灌注壓力流速監(jiān)測(cè)，供肝體外機(jī)械灌注時(shí)，通過(guò)壓力及流量傳感器，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)灌流期間門(mén)靜脈壓力及流量，同時(shí)實(shí)時(shí)計(jì)算顯示阻滯力。

1.2.2 肝功檢測(cè):實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組受體大鼠在移植后3 和24 h取血，肝功能ALT、AST及LDH均采用日本東京Hitachi 7600生化自動(dòng)分析儀。

1.2.3 組織病理學(xué)觀察:移植24 h后，麻醉，收集組織標(biāo)本，10% 甲醛固定，HE染色，光鏡下觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)變化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 移植后生存期

兩組大鼠移植后1～2 h內(nèi)麻醉蘇醒翻身，一天內(nèi)狀態(tài)良好，無(wú)死亡，兩組總體生存率100%，飲食飲水正常。

2.2 移植后大鼠肝功能(ALT、AST、LDH)

比較肝功能發(fā)現(xiàn)，移植后3和24 h時(shí)，F(xiàn)K506+HTK組ALT水平均低于HTK組(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with HTK group圖1 移植后大鼠肝功能(ALT、AST、LDH)Fig 1 Liver function of rats after transplantation(ALT,AST,LDH)

2.3 移植后大鼠肝臟形態(tài)學(xué)觀察

FK506+HTK組與HTK組移植后24 h肝臟細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，無(wú)顯著壞死；FK506+HTK組炎性因子浸潤(rùn)較HTK液組減少，表現(xiàn)出一定保護(hù)作用(圖2)。

圖2 移植后大鼠肝臟形態(tài)學(xué)Fig 2 Liver morphology of rats after transplantation(×200)

3 討論

肝移植已成為終末期肝病唯一有效的治療方法，機(jī)械灌注是一種有效的器官保存技術(shù)及器官保護(hù)和修復(fù)平臺(tái)[7]。早期研究發(fā)現(xiàn)[8]，F(xiàn)K506作為器官移植術(shù)后抗排斥反應(yīng)的一線免疫抑制劑，將肝臟大部切除術(shù)后的死亡率由100%下降至20%[9-10]。FK506沖洗肝臟在臨床試驗(yàn)中遇到的困難，可能與沖洗肝臟的處理時(shí)間太短、濃度不合適等因素相關(guān)[11]。

本研究通過(guò)搭建新型大鼠肝臟灌注平臺(tái)，建立一套具有溫度、流速和壓力可控的機(jī)械灌注系統(tǒng)。添加FK506的HTK液灌注離體大鼠肝臟，并進(jìn)行肝移植。結(jié)果表明，灌流系統(tǒng)可有效穩(wěn)定灌注大鼠肝臟，所有灌肝臟的移植受者大鼠均正常蘇醒并存活，表明灌注系統(tǒng)可有效灌注肝臟。

為進(jìn)步一步探究FK506對(duì)移植后大鼠移植物功能的影響，本研究發(fā)現(xiàn)FK506對(duì)移植后3和24 h時(shí)受體的肝功能具有顯著的保護(hù)作用。因此本研究提示FK506體外灌注大鼠肝臟，有可能對(duì)移植后的肝功能具有一定的保護(hù)作用。Kupper細(xì)胞活化介導(dǎo)組織炎性損傷，引起肝功能的損害[12]。在移植后，兩組肝臟均表現(xiàn)出完整組織結(jié)構(gòu)，無(wú)顯著細(xì)胞凋亡和壞死。相對(duì)于對(duì)照組，F(xiàn)K506組的中性細(xì)胞浸潤(rùn)顯著減少，提示對(duì)術(shù)后肝臟炎性反應(yīng)可有一定的抑制作用(圖2)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)FK506可通過(guò)體外機(jī)械灌注技術(shù)對(duì)大鼠肝臟起到一定的保護(hù)作用。降低肝移植術(shù)后肝功能損傷，抑制炎性反應(yīng)，保護(hù)肝臟。此外本研究為對(duì)其如何保護(hù)肝臟功能的機(jī)制未做探究。本團(tuán)隊(duì)將在接下來(lái)的研究中進(jìn)行深入探究其潛在的可能機(jī)制。